1株从冰葡萄汁中分离的德巴利酵母菌的鉴定及耐性研究*

刘壮，冮洁，涂茂林，谢彬，胡文忠，张平

1(大连民族大学生命科学学院，辽宁大连，116600)2(辽宁五女山米兰酒业有限公司，辽宁 本溪，117201)

冰葡萄酒是以自然条件下冰冻的葡萄为原料，在结冰状态下压榨，低温发酵，酿制而成的甜葡萄酒。由于其独特浓郁的甜香、醇厚风味，加上繁复、严谨、漫长的酿造过程使其身价倍增，因而被誉为“液体黄金”［1］。冰葡萄酒是冰葡萄汁经低温发酵而成的，由于冰冻的葡萄中的水分一部分蒸发，一部分结冰。因此，冰葡萄汁的糖、酸得到浓缩，使冰葡萄汁具有很高的渗透压和黏度，这要求发酵冰葡萄酒的酵母菌要具有很强的耐受性。目前我国冰葡萄酒发酵主要采用的是进口的酿酒酵母，如德国的W15，法国的K1、RHST、KD、DV10、EC1118 等［2］。我国自主品牌的冰葡萄酒发酵酵母很少。黄英子对甘肃祁连酒庄冰酒主栽品种(美乐、贵人香)自然发酵和接种发酵过程中采集到的酵母菌株进行归类鉴定，美乐冰红中共分离到6属6种酵母菌:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、戴尔有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)、耐热克鲁维酵母(Lachancea thermotolerans)、葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)、核果梅奇酵母(Metschnikowia aff.fructicola)和亚膜汉逊酵母(Pichia subpelliculosa)，贵人香冰白中共分离到6属8种:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、戴尔有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)、葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)、耐热克鲁维酵母(Lachancea thermotolerans)、核果梅奇酵母(Metschnikowia aff.fructicola)、嗜高压有孢汉生酵母(Hanseniaspora osmophila)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)［3］。赵新节在云南德钦产区的赤霞珠冰葡萄自然发酵过程中发现5种酵母菌，分别为 Cryptococcus flavescens、Cryptococcus amylolentus、Hyphopichiapseudoburtonii、Hanseniasporauvarum、Saccharomyces cerevisiae［4］。本文主要对 1株从辽宁本溪种植的威代尔冰葡萄汁中分离获得的冰葡萄酒发酵性能优良的酵母菌进行鉴定和耐性研究，为丰富冰葡萄酒发酵酵母菌的种类，利用本土优良酵母资源发酵冰葡萄酒提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与器材

冰葡萄汁，辽宁本溪五女山米兰酒业提供的威代尔冰葡萄汁。

YEPD培养基(g/L):葡萄糖20.0，蛋白胨20.0，氯霉素0.2，琼脂40.0，酵母膏10.0;

WL培养基(g/L):葡萄糖50.0，胰蛋白胨5.0，酵母粉 5.0，KH2PO40.55，KCl 0.425，CaCl20.125，MgSO40.125，MnSO40.002 5，FeCl30.002 5，溴甲酚绿0.022，琼脂17.0;

葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、溴甲酚绿、KH2PO4、FeCl3、MnSO4、MgSO4、CaCl2试剂均购自上海晶纯生化科技股份有限公司。

BS 223S电子精密天平，赛多里斯科学仪器(北京)有限公司;ZHJH-C2112B无菌操作台，上海智城分析仪器制造有限公司;UV-2000紫外可见分光光度计，UNICO;HNY-100B恒温培养振荡器，天津市欧诺仪器仪表有限公司;H2050R台高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酵母菌的分离纯化

冰葡萄汁进行10倍梯度稀释后取0.1 mL涂布于YEPD平板培养基上，28℃恒温培养3 d，得到单菌落，分别挑取不同形态的单菌落再次划线接种于YEPD培养基中，28℃恒温培养培养3 d，将得到的酵母菌单菌落接种于YEPD培养基斜面，28℃恒温3 d，然后放于 -4 ℃冰箱中保存［5］。

1.2.2 酵母菌的形态观察

(1)菌落特征观察:将分离纯化得到的酵母菌平板划线接种于WL鉴别培养基，28℃恒温培养5 d，观察培养基中菌落的特征［6-7］。

(2)细胞形态观察:挑取纯化得到的酵母菌，用1%吕氏美蓝染色剂染色，分别制片，在显微镜下观察酵母菌的形态［8］。

1.2.3 生理生化实验

1.2.3.1 葡萄糖发酵实验:参照文献［9-10］进行。

1.2.3.2 KNO3同化实验:参照文献［11-12］进行。

1.2.3.3 尿素分解实验:参照文献［10-12］进行。

1.2.3.4 肌醇同化实验:参照文献［12］进行。

1.2.4 酵母菌的分子鉴定

酵母菌的分子鉴定的方法采用26S rDNA D1/D2区序列分析。将保存的菌种委托宝生物公司进行测序，将测序结果输入 www.NCBI.nlm.nih.gov，利用BLAST软件，将测得的基因序列与Genbank数据库的序列进行同源性比较。结合形态学等特性确定酵母菌种属［13-14］。

1.2.5 酵母菌的耐性试验

酵母菌液的制备:挑取试管保存的酵母菌于装有100 mL富集培养基的三角瓶中，28℃摇床(130 r/min)培养48 h，再将此酵母液稀释到1 L，得到酵母菌活化液，酵母菌浓度达到2×107个/mL，于 -4℃保存待用。酵母菌菌体浓度用血球计数板测定［15］。

耐糖能力实验:取灭菌后的10 mL试管，加入9.0 mL 的蔗糖质量浓度分别为 200、250、300、350、400、450g/L的液体培养基，再加入1.0 mL酵母菌液，于28℃摇床(130 r/min)培养24 h。测定600 nm下菌液的OD值，从而确定酵母菌对糖的耐受情况［15-16］。

耐SO2能力实验:取灭菌后的10 mL试管，加入9.0 mL 质量浓度分别为 60、120、180、240、360、420 mg/L的SO2液体培养基，再加入1.0 mL冰葡萄酵母活化液，28℃摇床(130 r/min)培养24 h。测定600 nm下菌液的OD值，从而确定酵母菌对SO2的耐受情况［15，17］。

耐乙醇能力实验:取灭菌后的10 mL试管，加入9.0 mLC2H5OH 浓度分别为 70、90、110、130、150、180 mL/L的液体培养基，再加入1.0 mL冰葡萄酵母活化液28℃摇床(130 r/min)培养24 h。测定600 nm下菌液的OD值，从而确定酵母菌对乙醇的耐受情况［15-16］。

耐酸能力实验:取灭菌后的10 mL试管，分别加入9.0 mL的液体培养基，使 pH分别为:2.4、2.8、3.2、3.4、3.8，再加入1.0 mL 冰葡萄酵母活化液，于28℃摇床(130 r/min)培养24 h。测定600 nm下菌液的 OD值，从而确定酵母菌对 pH的耐受情况［15-16］。

2 结果与讨论

2.1 酵母菌的分离纯化结果

采用1.2.1酵母菌的分离纯化方法从威代尔冰葡萄汁中共分离到60株酵母菌，对这60株酵母菌进行了形态学、生理生化和分子生物学鉴定，获得德巴利酵母(Debaryomyces)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)等菌株。由于首次在冰葡萄汁中分离获得德巴利酵母。因此，对其形态特征、生理生化特性和耐受性进行了详细的研究。

2.2 WL培养基菌落形态观察结果

将分离纯化得到的德巴利酵母接种于WL鉴别培养基上进行形态聚类，德巴利酵母在WL培养基上呈现一种形态，如图1所示，表现为:中央淡绿色，周围白色，略凸起，表面干燥，边缘整齐。

2.3 德巴利酵母细胞形态观察结果

通过显微镜对德巴利酵母菌体形态进行观察，结果如图2所示。德巴利酵母细胞为椭圆形，平均大小为 4.5 μm ×5.4 μm，呈出芽繁殖。

2.4 生理生化实验结果

2.4.1 葡萄糖发酵实验

以葡萄糖为碳源的酵母菌，能发酵葡萄糖产生丙酮酸通过三羧酸循环等复杂代谢途径形成酸性代谢产物使溴甲酚紫指示剂变为黄色。如果代谢过程伴有产气，则在指示剂变黄的同时小杜氏管中有气泡出现［9-10］。实验结果如表1所示，从第2天开始，培养基的颜色从紫色渐渐变为黄色，第4天时颜色基本为黄色，之后颜色保持不变。在这7天中始终无产气现象。说明德巴利酵母能发酵葡萄糖形成酸性代谢产物，但代谢过程不产生气体。

图1 德巴利酵母WL培养基鉴别结果Fig.1 The result of Debaryomyces identification on WL medium

图2 德巴利酵母显微镜观察结果(×1000)Fig.2 The result of Debaryomyces observation by the microscope

表1 德巴利酵母葡萄糖发酵实验结果Table 1 The results of Debaryomyces glucose fermentation experiment

2.4.2 KNO3同化实验

德巴利酵母在不含氮源但添加了KNO3的培养基中培养7 d后，培养基变浑浊，说明该德巴利酵母的生长情况良好。同时观察到德巴利酵母在培养液中并未形成菌膜或菌环。

2.4.3 尿素分解实验

有些酵母菌能产生脲酶，可分解尿素形成大量的氨，使得培养基 pH升高，使酚红指示剂显红色［10-12］。

分离纯化的德巴利酵母在尿素分解培养基上培养，培养基始终未变红，说明该酵母菌不能产生脲酶。

2.4.4 肌醇同化实验

分离纯化的德巴利酵母接种入肌醇同化培养基，培养7 d后，观察到培养基未变浑浊，说明该酵母菌的生长情况较差，不能利用肌醇作为碳源，同时观察到培养液中没有形成菌膜或菌环。

2.5 德巴利酵母的分子鉴定

对酵母菌的26S rDNA D1/D2区序列分析，如图3所示，分离到的酵母菌的PCR产物长度为557 bp。电泳图中的阳性对照是试剂盒中的Control DNA的PCR扩增产物，条带清晰，大小正确，说明所使用扩增体系正确，阴性对照是试剂盒中的dH2O的PCR扩增产物，说明扩增的过程中不存在DNA污染。

图3 德巴利酵母26S rDNA D1/D2区PCR产物电泳图谱Fig.3 The PCR electrophoretogram of Debaryomyces 26S rDNA D1/D2 region

将测序结果输入 www.NCBI.nlm.nih.gov，利用BLAST软件，将测得的基因序列与 Genbank数据库的序列进行同源性比较。序列NCBI BLAST比对结果见表2。

在表2中，匹配分值与总体分值为比对得分，分值越高，两个序列相似性越高。随机匹配可能性越小，可信度越高，它的值接近零或为零时，代表完全匹配。由表2可以看出分离得到的酵母菌与各株汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)的同源性均达到100%，结果表明分离得到的酵母菌属于德巴利酵母属。德巴利酵母能发酵葡萄糖产D-阿拉伯糖醇显著改善酒精饮品的品质［18］。也可以在受伤的柑橘表面快速繁殖，对柑橘保护酶的诱导有积极作用，抵御病虫害［19］。还用于生产优质饲料用菌体蛋白［20］。

表2 德巴利酵母的序列比对分析结果Table 2 The results of Debaryomyces sequence comparison and analysis

2.6 酵母菌的耐受性实验结果

2.6.1 德巴利酵母对糖的耐受情况

冰葡萄汁具有含糖量高的特点，通常其含量为350～420 g/L。因此优良的冰酒酵母菌必须具有良好的耐糖性。该株德巴利酵母对糖的耐受性如图4所示。含糖量为250 g/L时最适宜其生长，在含糖量为450 g/L时仍具有较高生长量，菌体浓度为2.1×107个/mL，说明其耐糖性能较好，可作为冰酒酿造的菌种。

图4 德巴利酵母对糖的耐受结果Fig.4 The results of Debaryomyces glucosetolerance experiment

2.6.2 德巴利酵母对SO2的耐受情况

冰酒的酿造过程中会添加一定量的SO2，因此酵母菌对SO2的耐受情况也应作为筛选酵母菌的指标。由图5可得出结论:该株德巴利酵母的生长量随SO2浓度的升高而降低，但当SO2的浓度达到420 mg/L时，菌体浓度仍可达到1×107个/mL，表现出了对SO2良好的耐受性。

图5 德巴利酵母对SO2的耐受结果Fig.5 The results of Debaryomyces sulfur dioxide tolerance experiment

2.6.3 德巴利酵母对乙醇的耐受情况

成品冰酒的酒精度一般为11o，性状优良的酵母菌必须具备能耐高酒精度特点。由图6可知:该株德巴利酵母对乙醇有一定的耐受性，乙醇含量达到18%时，OD600nm为0.031，菌体浓度为 4 ×106个/mL，表现出对乙醇具有较好的耐受性，可用于冰酒酿造过程中。

2.6.4 德巴利酵母对酸的耐受情况

冰葡萄汁的pH一般为3.3左右，因而优良的酵母菌种应具备耐酸的能力。由图7酵母菌对pH的耐受结果可以看出:该株德巴利酵母在pH为3.2时生长量为最大，菌体浓度达到1.5×107个/mL，表明具有较好的酸耐受性，可在冰酒酿造过程中使用。

图6 德巴利酵母对乙醇的耐受结果Fig.6 The results of Debaryomyces alcohol tolerance experiment

图7 德巴利酵母对pH的耐受结果Fig.7 The results of Debaryomyces acid tolerance experiment

3 结论

本研究从辽宁本溪地区的威代尔冰葡萄汁中共分离获得60株酵母菌，对这60株酵母菌进行了形态学、生理生化和分子生物学鉴定，鉴定出德巴利酵母(Debaryomyces)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)等菌株，说明辽宁本溪地区冰葡萄上的酵母菌具有较好的多样性。为研究本土葡萄酿酒微生物资源的生物多样性，分离收集优质葡萄酒产区酵母菌株提供参考。

本研究首次在冰葡萄汁中分离获得德巴利酵母菌，通过德巴利酵母的耐受性实验结果可以看出:该株德巴利酵母对糖、SO2、乙醇和酸均有较强的耐受性。在含糖量450 g/L、SO2浓度420 mg/L、乙醇含量18%、pH 3.8时，仍可保持106个/mL以上的生物量，说明分离获得的该株德巴利酵母适合应用在冰葡萄酒的酿造中。虽然德巴利酵母能发酵葡萄糖产D-阿拉伯糖醇显著改善酒精饮品的品质［18］，但还未应用到冰酒酿造过程中。在未来研究中，可作为增香菌株，与酿酒酵母共同发酵，为生产出更具地方特色，风格独特的冰葡萄酒奠定物质基础。

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