解酒保肝活菌饮料的发酵工艺*

洪金艳，李洪军，2，贺稚非，2，邓泽丽，陈康

1(西南大学食品科学学院，重庆，4007150)2(重庆市农产品加工技术重点实验室，重庆，400715)

葛花(Flos puerariae)是豆科植物甘葛藤、野葛的花［1］，是传统的解酒醒脾中药。葛花中含有黄酮类化合物、皂苷类化合物、挥发油类化合物、氨基酸、甾醇类化合物、生物碱等活性物质［2］，具有解酒保肝［3］、保护胃肠道［4］、调节血糖血脂［5］、抗过敏［6］、消除活性氧和保护细胞［7］等作用。枳椇又称拐枣、金钩子、万寿果等，为鼠李科(Rhamnaceae)枳椇属(Hovenia thunb.)落叶乔木，枳椇子为枳椇的果实或种子，是传统的解酒醒脾中药［8］。国内外学者已经从枳椇子中分离出70多种成分，如黄酮类化合物、三萜皂苷类化合物、生物碱类化合物、多糖类化合物等［9-10］。并研究发现，枳椇子具有解酒保肝［11］、抗脂质过氧化［12］、抗突变抗肿瘤［13］、调理胃肠道［14］、抑制组胺释放、增强综合体能［12］等作用。本研究采用植物乳杆菌发酵葛花与枳椇子的提取液，优化发酵型解酒保肝活菌饮料的发酵工艺，为葛花与枳椇子的利用开发和发酵型解酒保肝活菌饮料的生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂

葛花，广西玉林;枳椇子，湖北恩施;脱脂奶粉，内蒙古伊利实业集团股份有限公司;植物乳杆菌，韩国圃美多公食品有限司;葡萄糖，蔗糖，NaOH，蛋白胨，牛肉膏，酵母膏，K2HPO4·3H2O，柠檬酸二铵，CH3COONa，吐温 -80，MgSO4·7H2O，MnSO4·4H2O，琼脂，NaNO2，Al(NO3)3，芦丁(98%)。

1.1.2 仪器设备

HH-W4型数显恒温水浴锅，上海赫田科学仪器有限公司;SS-325型高压灭菌锅，日本 TOMY公司;DHP-9272型电热恒温培养箱，上海齐欣科学仪器有限公司;DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司;UB-7型pH计，德国Sartorius AG公司;UV-2450型紫外可见分光光度计，日本岛津公司;YP2001N型电子天平(感量2 000 g)，上海舜宇恒平科学仪器有限公司;FA2004型分析天平(感量0.000 1 g)，上海精密科学仪器有限公司;DL-1型万用电炉，北京市中兴伟业仪器有限公司;103B型高速中药粉碎机，瑞安市永历制药机械有限公司;SW-CJ-1F型超净工作台，江苏苏净安泰空气技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程

1.2.2 操作要点

1.2.2.1 菌种的活化、驯化及发酵剂的制备［15-17］

在无菌环境下，分别将少量植物乳杆菌PMO菌种纯菌粉接种于灭菌后的10%脱脂乳粉液中，在其最适生长温度下活化，传代3次，使其活力达到正常。将活化好的菌种接种于不同比例的脱脂乳粉与提取液的混合液中逐步驯化，驯化过程见表1。在提取液中加入6%的葡萄糖，杀菌后加入3%驯化后的菌种，在最适温度下培养制成发酵剂。接种驯化后的菌种于MRS固体培养基，用液体石蜡液封，4℃保藏待用。

表1 驯化培养基的制备Table 1 The preparation of domestication culture medium

1.2.2.2 提取液的制备

挑取优质的葛花和枳椇子，按葛花与枳椇子质量比为2∶1，料液比1∶21称取加水浸泡30 min后，在电炉上煮沸84 min，过滤得滤液，加同量的水再次提取，过滤得滤液，合并滤液待用。

1.2.2.3 混合、杀菌

在50 mL提取液中加入6%糖(蔗糖与葡萄糖为3∶2)作为碳源，混合均匀，70℃保温30 min杀菌。

1.2.2.4 接种、发酵

按无菌操作要求，将驯化培养得到的发酵剂接入杀菌冷却后的提取液中，然后于恒温培养箱中发酵，16 h后取出放置在4℃低温条件下冷藏。

1.2.3 发酵工艺条件的确定

1.2.3.1 发酵单因素试验

葡萄糖与蔗糖比例的确定:称取6%的糖(蔗糖与葡萄糖比例分别为 1∶3、2∶3、1∶1、3∶2、3∶1)加入 50 mL提取液中，70℃保温30 min后，冷却到35～40℃，在超净工作台上按照3%的比例将发酵剂接种于提取液中，于37℃的恒温培养箱中培养16 h。每个比例做3个平行，然后对发酵饮料的活菌数对数值、总酸含量、pH、总黄酮含量及感官进行分析，以探讨葡萄糖与蔗糖的添加比例对饮料发酵工艺的影响(以下每项单因素试验均设3个平行，并进行同类项目检测及分析。)。

接种量的确定:称取6%的糖(蔗糖与葡萄糖比例为3∶2)加入50 mL提取液中，70℃保温30 min后，冷却到35～40℃，在超净工作台上分别按照2%、3%、4%、5%、6%的比例将发酵剂接种于提取液中，然后放置在37℃的恒温培养箱中培养16 h。

发酵温度的确定:称取6%的糖(蔗糖与葡萄糖比例为3∶2)加入50 mL提取液中，70℃保温30 min后，冷却到35～40℃，在超净工作台上按照3%的比例将发酵剂接种于提取液中，然后分别放置在35、37、39、41、43 ℃的恒温培养箱中培养 16 h。

发酵时间的确定:称取6%的糖(蔗糖与葡萄糖比例为3∶2)加入50 mL提取液中，70℃保温30 min后，冷却到35～40℃，在超净工作台上按照3%的比例将发酵剂接种于提取液中，然后放置在37℃的恒温培养箱中分别培养 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 h。

糖添加量的确定:分别称取4%、5%、6%、7%、8%、9%的糖(蔗糖与葡萄糖比例为3∶2)加入50 mL提取液中，70℃保温30 min后，冷却到35～40℃，在超净工作台上按照3%的比例将发酵剂接种于提取液中，然后放置在37℃的恒温培养箱中培养16 h。

1.2.3.2 发酵工艺优化正交试验

根据单因素试验结果，选取接种量、发酵温度、发酵时间、糖添加量4个因素设计L9(34)正交试验，以活菌数对数值和感官为评价指标，确定工艺条件。

表2 植物乳杆菌PMO菌种发酵工艺L9(34)正交试验因素水平表Table 2 L9(34)arrangement of orthogonal test of the fermentation process of L.plantarum PMO

1.2.4 检测方法

（2）过度地迎合市场预期以及二级市场的炒作造成的管理舞弊。这种过度地迎合市场预期以及二级市场的炒作的主要目的就是通过利用虚假的财务信息来操纵股票市场的价格，因为股价的上升和下降会直接受到公司财务情况的影响。因此有一些公司就为了让股价达到自己预想的波动水平就会进行管理舞弊，以虚假的财务信息来对股价进行有效的操纵。例如，某物业公司为了让股价达到自己预想的波动水平，蓄意提供一些不实的财务信息，从而导致股价暂时下跌，这种股价暂时下跌的现象会在很大程度上有利于操纵者低价买入来获得更大的控制权或者待价而沽。这也是我国上市公司管理舞弊成因的主要原因［3］。

1.2.4.1 总酸的测定

总酸参考《GB/T 12456—2008》［20］中的电位滴定法;乳酸菌活菌数按《GB 4789.35—2010》［21］中的规定;总黄酮含量测定按《DB13/T385—1998》［22］中的规定;感官检测参考《GB/T 12315—2008》［23］中的检验项目、要求和方法，对发酵饮料进行感官品评综合打分。感官品评打分标准见表3。

1.2.4.2 正交试验指标的归一化计算［22-23］

正交试验以活菌数对数值和感官为指标，需对正交试验各指标数据进行归一化处理，按式(1)计算各指标观测值的评分值，然后按照加权平均的方法综合指标值，权值分配均为0.5。

设各个指标的最大值yjmax对应yjmax'=100分，最小值yjmin对应yjmin'=0分。

表3 发酵饮料感官评分标准Table 3 Standards of sensory evaluation of fermented beverages

式中:yij是指标观测值的评分值。

1.2.5 数据处理

数据采用SPSS 19.0软件进行统计分析，结果以平均值±标准偏差表示，以P＜0.05为差异显著性判断标准;Origin软件绘制图表。

2 结果与讨论

2.1 菌种的驯化

从图1可以看出，随着驯化培养基中提取液比例的增加，总酸含量和活菌数对数值逐渐下降。脱脂奶粉中含有乳酸菌生长需要的乳糖［15-17］，而提取液中含糖较少，所以乳酸菌在提取液中的产酸量和活菌数量均不能达到脱脂乳中的水平。当培养基中提取液含量达到60%时，乳酸菌在培养基中的总酸量和活菌数量已高于驯化前，当培养基中提取液含量为100%时，乳酸菌在培养基中的总酸量均比驯化前高出了1倍，活菌数对数值比驯化前高了1～1.5 lgCFU/mL。乳酸菌经过驯化，在提取液中的总酸量和活菌数量都得到了改善，以适应纯提取液发酵体系。

2.2 乳酸菌发酵工艺的单因素实验条件研究

2.2.1 蔗糖与葡萄糖比例的单因素实验

糖作为微生物生长的碳源，纯蔗糖或纯葡萄糖都不利于乳酸菌的生长和发酵风味的形成。葡萄糖利于乳酸菌的生长繁殖，蔗糖利于优质发酵风味的形成，所以用部分葡萄糖代替蔗糖对发酵饮料的品质更有利［17，24］。由图2(a)可知，随着蔗糖比例的增加，活菌数对数值呈下降趋势，在蔗糖与葡萄糖比例为3∶2时出现拐点，活菌数急剧下降。随着蔗糖比例的增加，总黄酮含量变化不明显，蔗糖与葡萄糖的比例对总黄酮含量无影响。

图1 植物乳杆菌PMO菌种驯化培养基中的总酸(a)和活菌数对数值(b)Fig.1 Total acid medium(a)and the viable count of the value(b)of domesticated species of L.plantarum PMO

由图2(b)可知，随着蔗糖比例的增加，总酸呈逐渐下降的趋势，pH呈逐渐上升的趋势。

由图2(c)可知，随着蔗糖比例的增加，感官评分呈先升高后下降的趋势，在蔗糖与葡萄糖比例为3∶2时，感官最好。因此选择蔗糖与葡萄糖比例为3∶2。

2.2.2 乳酸菌接种量的单因素实验

不同接种量的乳酸菌会使发酵后的饮料中活菌数、总酸、pH和感官差异很大，影响了饮料的品质［15，17，24］。由图 3(a)可知，随着菌种接种量的增加，发酵后活菌数对数值呈先增加后减少的趋势，接种量从2%到4%，活菌数对数值增加明显，接种量从4%到6%，活菌数对数值下降趋势缓慢;随着接种量的增加，总黄酮含量变化不明显，可见菌种接种量对饮料的总黄酮的含量无影响。

由图3(b)可知，随着接种量的增加，发酵后总酸含量呈逐渐增加的趋势，接种量从2%到3%，总酸含量增加明显，而接种量从3%到6%，总酸含量增加较少，含量无明显差异;pH呈逐渐下降的趋势，接种量从2%到3%下降明显，从3%到6%下降趋势平缓。

由图由图3(c)可知，随着菌种接种量的增加，发酵饮料感官评分呈先上升后下降的趋势，在接种量为3%时感官评分最高。本实验选择接种量为3%。

图2 蔗糖与葡萄糖比例对植物乳杆菌PMO菌种发酵饮料的影响Fig.2 Effect of the ratio of sucrose and glucose for the fermented beverages of L.plantarum PMO

2.2.3 乳酸菌发酵温度的单因素实验

不同的发酵温度会导致发酵饮料的品质差异很大。有的发酵温度适合乳酸菌的生长繁殖，称为最适生长温度，有的发酵温度适合乳酸菌积累代谢产物，称为最适发酵温度。有些乳酸菌会在不同的发酵温度积累不同的代谢产物［24-26］。由图4(a)可知，随着发酵温度的升高，发酵后活菌数对数值呈逐渐减少的趋势，发酵温度从35℃到37℃，活菌数对数值减少程度不明显，而发酵温度从37℃到43℃，活菌数减少程度明显;随着发酵温度的升高，总黄酮含量变化不明显，可见菌种发酵温度对饮料的总黄酮的含量无影响。

图3 菌种接种量对植物乳杆菌PMO菌种发酵饮料的影响Fig.3 Effect of the amount of inoculated for the fermented beverages of L.plantarum PMO

由图4(b)可知，随着菌种发酵温度的升高，发酵后总酸含量呈先增加后下降的趋势，发酵温度从35℃到37℃，总酸含量增加，而发酵温度从37℃到43℃，总酸含量逐渐降低，降低趋势明显;pH呈先下降后逐渐升高的趋势，发酵温度从35℃到37℃ pH略有下降，而发酵温度从37℃到43℃，pH上升明显。

由图由图4(c)可知，随着菌种发酵温度的升高，发酵饮料感官评分呈先上升后下降的趋势，在发酵温度为37℃时感官评分最高。综合以上可见37℃时菌种产酸最多，且产生的酸有利于发酵风味的形成，因此菌种的最适发酵为37℃。

2.2.4 乳酸菌发酵时间的单因素实验

由图5(a)可知，随着发酵时间的延长，活菌数对数值呈先增加，再趋于平稳后下降的趋势，即在12～16 h期间，菌种处于生长稳定期，活菌数量最高。随着发酵时间的延长，总黄酮含量呈减少的趋势，但减少的趋势较弱，可能是随着时间的延长，黄酮被氧化，但黄酮在酸性环境中较稳定，乳酸菌代谢产生的酸对黄酮起了一定的保护作用。

图4 发酵温度对植物乳杆菌PMO菌种发酵饮料的影响Fig.4 Effect of fermentation temperature for the fermented beverages of L.plantarum PMO

由图5(b)可知，随着时间的延长，总酸逐渐增加，在0～12 h时，乳酸菌处于延滞期和对数期，产酸较少，在12～16 h时乳酸菌处于稳定期，产酸较多，在16～20 h时，乳酸菌开始衰亡，产酸较少，总酸增加较少。由于酸的含量越来越多，pH则与总酸相反，呈逐渐下降的趋势。

由图5(c)可知，随着时间的延长，由于乳酸菌的代谢产物种类和含量的不同，发酵饮料的感官评分呈先升高后降低的趋势，在发酵14 h时感官评分最高。综合以上，选择发酵时间为14 h。

2.2.5 糖添加量的单因素实验

由图6(a)可知，随着糖添加量的增加，活菌数对数值呈先增多再减少的趋势，在糖添加比例为7%时活菌数量较高。总黄酮含量不随糖添加比例的变化而变化。

由图6(b)可知，随着糖添加量的增加，总酸逐渐增加，在糖添加量为7%时增加较少，后趋于平稳。pH逐渐降低，在糖添加量为7%时降低较少，后趋于平稳。

图5 发酵时间对植物乳杆菌PMO菌种发酵饮料的影响Fig.5 Effect of fermentation time for the fermented beverages of L.plantarum PMO

由图6(c)可知，发酵饮料的感官评分随糖添加量的增加呈先升高后降低的趋势，在糖添加量为6%和7%时都较高，在7%时最高。综合考虑，糖添加量为7%时最优。

2.3 正交试验

由于总酸含量会影响发酵饮料的感官品质，总酸含量并非越高越高，pH变化与总酸含量变化呈负相关，总黄酮含量变化不明显，所以选择活菌数对数值和感官评分为正交试验测定指标。试验结果见表4。在影响活菌数对数值和感官评分的4个因数中，按主次顺序排列为B＞D＞C＞A，即温度对活菌数的影响最为重要，糖添加量次之，时间和接种量影响较小。最优组合为A2B2C1D2，即在接种量为3%，发酵温度为37℃，发酵时间为12 h，糖添加量为7%时发酵饮料的活菌数最高。

表4 正交试验结果Table 4 The results of orthogonal experiment

图6 糖添加量对植物乳杆菌PMO菌种发酵饮料的影响Fig.6 Effect of the amount of sugar for the fermented beverages of L.plantarum PMO

2.4 验证实验

根据正交试验优化得到的最优组合A2B2C1D2，即在接种量为3%，发酵温度为37℃，发酵时间为12 h，糖添加量为7%进行验证实验，测定活菌数对数值为8.584，感官评分为88，此时加权值为90。因此最优组合为A2B2C1D2，最佳发酵条件为:接种量3%，发酵温度37℃，发酵时间12 h，糖添加量7%。

3 结论

从综合分析的结果得出，影响活菌数对数值和感官评分的因素的主次顺序为:发酵温度＞糖添加量＞发酵时间＞菌种接种量。植物乳杆菌PMO菌种发酵饮料的发酵条件为:接种量为3%，发酵温度为37℃，发酵时间为12 h，糖添加量为7%。

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