超高效液相色谱三重四极杆质谱联用法测定蜂蜜中5种四环素类抗生素的探讨

刘兆峰钟启升

·论著·

超高效液相色谱三重四极杆质谱联用法测定蜂蜜中5种四环素类抗生素的探讨

刘兆峰1★钟启升2

目的建立一种超高效液相色谱仪和三重四极杆质谱仪联用测定蜂蜜中5种四环素类抗生素残留的方法。方法通过固相萃取富集样品中的四环素类抗生素后，使用超高效液相色谱快速分离，三重四极杆质谱仪进行定量分析。结果超高效液相色谱三重四级杆质谱联用法能定量检出蜂蜜中5种四环素类抗生素的残留，对5μg／L、10μg／L和50μg／L混合标准溶液的相对标准偏差在0.62％～3.79％之间，其检出限为31.9ng／L～63.4 ng／L，定量限为127 ng／L～254 ng／L，样品加标回收率在86.9％～98.1％之间。结论本法快速、准确、灵敏度高，能满足蜂蜜中5种四环素类抗生素残留的检测。

超高效液相色谱－三重四极杆质谱；四环素类抗生素；蜂蜜

四环素类抗生素（tetracyclines，TCs）包括金霉素（chlotetracycline）、土霉素（oxytetracycline）、四环素（tetracycline）、强力霉素（doxycycline）、去甲基金霉素（demeclocycline hydrochloride）等，是临床上广泛应用的广谱抗生素。然而，不合理地使用该类药物，如用药剂量过大、用药时间过长、滥用药物及不遵守休药期提前屠宰等，会导致该类药物及其代谢产物残留于动物的肌肉、蛋、奶、脏器组织及分泌物中。四环素类抗生素并不能被动物完全吸收，有相当部分以原形或代谢物形式进入食物链和环境中，直接或间接对人体健康造成影响［1］。

近年来，蜂蜜产业发展迅速。我国蜜蜂大多是从国外引进的意蜂，发病率比较高，虽然国家提倡生物防治，但还是有一部分人用化学药物、抗生素来给蜜蜂预防和治疗疾病，导致蜂蜜中抗生素含量较高［2-3］。因此，迫切需要建立蜂蜜中高效灵敏的抗生素检测方法。

高效液相色谱－串联质谱联用技术，特别是三重四级杆质谱仪可以进行母离子扫描、子离子扫描和中性丢失扫描，由于可以有效排除基质离子产生的非目标碎片离子的干扰，优化质谱检测信号，有效的防止了假阳性的检出，具有高的选择性和灵敏度，对复杂基体中的药物残留具有准确的定性能力，是近些年来发展很快的分析技术［4-6］。本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8040联用测定蜂蜜中的5种四环素类抗生素的方法，以给分析检测人员提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

本实验使用超高效液相色谱仪LC-30A与三重四极杆质谱仪LCMS-8040联用系统（岛津，日本）。具体配置为输液泵LC-30AD×2，在线脱气机DGU-20A5，自动进样器SIL-30AC，柱温箱CTO-30AC，系统控制器CBM-20A，三重四极杆质谱仪LCMS-8040，色谱工作站为LabSolutions Ver.5.53。

1.2 分析条件

液相条件：使用Shim-pack XR-ODS II（2.0mm I.D.×100mm L.，2.2μm粒径）色谱柱；流动相A为0.1％甲酸的水溶液，流动相B为甲醇；流速为0.25 m L／min；柱温为室温；进样量为20μL；洗脱方式为梯度洗脱，B相初始浓度为20％，洗脱程序见表1。

质谱条件：离子化模式为电喷雾离子源（正离子）；离子喷雾电压为4.5 kV；雾化气为3.0 L／m in流速氮气；干燥气为15 L／m in流速的氮气；碰撞气为氩气；去溶剂管温度为250℃；加热模块温度为400℃；扫描模式为多反应监测（multiple reacting monitoring，MRM），化合物信息和MRM优化参数见表2；驻留时间为10ms；延迟时间为3ms。

1.3 样品制备

标准溶液配制：称取适量5种标准物质，分别为四环素、土霉素、去甲基金霉素、金霉素和强力霉素，用甲醇配制1 000mg／L的混合标准储备液，用甲醇＋0.1甲酸水溶液（V／V，1∶4）稀释成不同浓度的混合标准工作液。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Program of gradientelution

蜂蜜：市售蜂蜜。

样品前处理方法：蜂蜜样品的制备、净化、提取参照《GB／T 23409-2009蜂王浆中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定液相色谱-质谱／质谱法》［7］。

1.4 加标回收率计算

加标回收率按以下公式计算：加标回收率＝（加标样品检出浓度－样品基质中检出浓度）／加标浓度×100％。

2 结果

2.1 标准样品一级质谱图和产物离子扫描质谱图

对5种四环素标准样品进行一级质谱图和产物离子扫描。由结果显示，5种四环素均能得到加氢峰，其产物离子碎片均较为丰富。四环素的一级质谱图见图1，产物离子扫描质谱图见图2。土霉素的一级质谱图见图3，产物离子扫描质谱图见图4。去甲基金霉素的一级质谱图见图5，产物离子扫描质谱图见图6。金霉素的一级质谱图见图7，产物离子扫描质谱图见图8。强力霉素的一级质谱图见图9，产物离子扫描质谱图见图10。

2.2 标准样品的MRM色谱图

图11为100μg／L 5种四环素标准样品在最优色谱条件下得到的MRM色谱图。5种四环素峰型对称、尖锐，分离度良好，基线较为平稳。

2.3 线性范围

将0.2μg／L、0.5μg／L、1μg／L、2.5μg／L、5 μg／L、10μg／L、50μg／L、100μg／L和200μg／L不同浓度的混合标准工作液按1.2中的分析条件进行测定，外标法定量。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制校准曲线；所得校准曲线线性关系良好，线性方程及相关系数见表3。

表2 化合物信息和MRM优化参数Table 2 Compound informations and MRM optimal parameters

图1 四环素的一级质谱图Figure 1 Firstordermass spectrum of tetracycline

图2 四环素的产物离子扫描图（CE值-20V）Figure 2 Ion scanning graph of tetracycline products（CE-20V）

图3 土霉素的一级质谱图Figure 3 Firstordermass spectrum of oxytetracycline

图4 土霉素的产物离子扫描图（CE值-19V）Figure 4 Ion scanning graph of oxytetracycline products（CE-19V）

图5去甲基金霉素的一级质谱图Figure 5 Firstordermass spectrum of ledermycin

图7 金霉素的一级质谱图Figure 7 First ordermass spectrum of chlortetracycline

图8 金霉素的产物离子扫描图（CE值-22V）Figure 8 Ion scanning graph of chlortetracycline products（CE-22V）

图9 强力霉素的一级质谱图Figure 9 Firstordermass spectrum of doxycycline

图10 强力霉素的产物离子扫描图（CE值-19V）Figure 10 Ion scanning graph of doxycycline products（CE-19V）

2.4 精密度实验

对不同浓度混合标准工作液连续测定6次，考察仪器的精密度，保留时间和峰面积的重复性结果如表4所示。结果显示：不同浓度标准品保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.20％～1.34％和0.62％～3.79％之间，仪器精密度良好。

1.四环素；2.土霉素；3.去甲基金霉素；4.金霉素；5.强力霉素

图12 无加标蜂蜜样品样的MRM色谱图（检出1为四环素）Figure 12 MRM chromatography of non-spiked honey sample（detected 1：tetracycline）

图13 蜂蜜加标（2μg／kg）样品的MRM色谱图Figure 13 MRM chromatography of honey sample adding standard solution（2μg／kg）

表3 校准曲线参数Table 3 Parameters of calibration curve

表4 保留时间和峰面积重复性结果（n＝6）Table 4 The repeatability results of retention time and peak area（n＝6）

表5 四环素类抗生素的检出限和定量限Table 5 The lim its of detection and lim its of quantitation of tetracycline

2.5 检出限

配制浓度为为200 ng／L标样7份，直接进样分析，将平行7次测定结果计算标准偏差S，此时检出限MDL＝3.14×S，定量下限LOQ＝4×MDL。测定结果如表5所示。

2.6 回收率实验

以蜂蜜为待测样品，检测5种四环素类抗生素。在2 g蜂蜜样品中检出四环素，浓度为0.249 μg／kg，色谱图（图12）峰型平滑、尖锐，其他3种四环素类抗生素没有标准峰型出现。为了研究该分析方法对蜂蜜样品中四环素类抗生素的实际检测效果，向蜂蜜样品中加入浓度为2μg／kg的5种四环素类抗生素标准物质，加标色谱图（图13）5种四环素类抗生素均出现平滑尖锐峰型经加标回收率（表6）计算，其平均回收率分别为四环素98.1％、土霉素95.2％、去甲基金霉素86.9％、金霉素88.3％、强力霉素为98.1％。

3 讨论

目前，液相质谱联用技术已广泛用于微生物、蛋白质组学、化学生物学等学科，在探究新的机理、新的化合物方面发挥着越来越重要的作用［8－11］。同时，在药物和食品残留分析方面，与蜂蜜中四环素族检测传统标准方法［12］相比，液相质谱联用技术检测速度更快、定量更准确、分析四环素类化合物的具体种类更精确，指导食品行业发展更有指向性，提供给执法部门的数据更明确，大大提高了相关部门的效率。以四环素、土霉素、强力霉素和金霉素与前处理方法相同的GB／T 23409－2009［7］相比，其加标回收率土霉素（95.2％）比85.2％～120.8％的回收率提高10％左右，四环素（98.1％）比73.5％～115.4％的回收率提高20％左右，强力霉素（98.1％）比65.8％～115.2％的回收率提高20％左右，

金霉素的加标回收率也有所提高。

使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8040联用测定蜂蜜样品中的四环素类抗生素MRM色谱图峰型对称、尖锐，分离度良好，基线较为平稳，同时校准曲线的相关系数都在0.999 6以上，说明该检测方法和前处理方法适合检测蜂蜜中四环素类抗生素残留，可以进一步研究稳定条件，提高检测精度和准度，使其作为国标或行标被检测单位所采用。

本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8040联用测定蜂蜜样品中的四环素类抗生素残留量的检测方法，该方法前处理简单，分析时间快，灵敏度高，精密度良好，且线性范围宽，相关系数在0.999 6以上，对5μg／L、10μg／L和50μg／L混合标准溶液的相对标准偏差在0.62％～3.79％之间，其检出限为31.9 ng／L～63.4 ng／L，定量限为127 ng／L～254 ng／L。通过对市售蜂蜜样品的测定，能够检测出微量四环素，对蜜蜂样品进行加标分析，得到样品加标回收率在86.9％～98.1％之间，证明该方法适合蜂蜜样品种衡量四环素的分析检测。

表6 四环素类抗生素加标回收率结果Table 6 The recoveries results of tetracyclines in honey

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Discussion on determ ination of 5 kinds of tetracyclines residues in honey by ultra-performance liquid chromatography coup led w ith triple quadrupole mass spectrometry

LIU Zhaofeng1★,ZHONG Qisheng2
(1.Guangdong Institute for Food and Drug Control,Guangzhou,Guangdong,China,510180；2.Analytical Center,Guangzhou Branch,Shimadzu(China)Co.,LTD.,Guangzhou,Guangdong,China,510010)

Objective To establish amethod for determ ination of 5 tetracyclines residues in honey by the ultra-performance liquid chromatography coupled w ith triple quadrupolemass spectrometry(UPLC-MS/ MS).Methods A fter concentrated by solid phase extraction,5 tetracyclines in honey were then separated by ultra-performance liquid chromatography and quantified by triple quadrupolemass spectrometry.Results The 5 tetracyclines residues in honey were quantify detected by UPLC-MS/MS.The relative standard deviations of 5 μg/L、10μg/L and 50μg/Lmixed standard solution were in the range of 0.62％～3.79％.The limits of detection and lim its of quantitation were 31.9 ng/L～63.4 ng/L and 127 ng/L～254 ng/L,respectively.The recoveries of three spiked levelswere range from 86.9％～98.1％.Conclusion Themethod of UPLC-MS/MS is rapid,accurate,sensitive and canmeet the requirements for the determination of 5 tetracyclines residues in honey.

Ultra-performance liquid chromatography coupled w ith triple quadrupolemass spectrometry(UPLC-MS/MS)；Tetracyclines；Honey

1.广东省食品药品检验所，广东，广州510180 2.岛津企业管理（中国）有限公司广州分公司分析中心，广东，广州510010

★通讯作者：刘兆峰，E-mail：9016117＠qq.com