广西人群TGF-β1基因rs1800469 C／T遗传多态性的研究

黄华佗 罗宏成 向阳 陈健明 吴成将 韦叶生

·论著·

广西人群TGF-β1基因rs1800469 C／T遗传多态性的研究

黄华佗 罗宏成 向阳 陈健明 吴成将 韦叶生★

目的研究转化生长因子β1（TGF-β1）基因rs1800469C／T位点多态性各等位基因及基因型在广西人群中的分布频率，比较其在不同种族间的分布差异。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术和DNA测序法检测210例广西人群TGF-β1基因rs1800469C／T位点多态性，并结合文献进行不同种族间的比较分析。结果广西人群中，TGF-β1基因rs1800469C／T位点表现出CC、CT、TT三种基因型，频率分别为24.3％、49.5％、和26.2％，C、T等位基因型频率分别为49.0％和51.0％。其基因型及等位基因频率在男女间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。进一步将其分型数据与人类基因组计划公布的4个人群和参考文献中部分种族人群比较发现，广西人群中，TGF-β1基因rs1800469C／T位点基因型及等位基因频率与英国人、土耳其人、欧洲人（HapMap-CEU）和非洲人（HapMap-YRI）比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），而与日本人（HapMap-JPT）、北京汉族人（HapMap-HCB）、福州人和重庆汉族人比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论在广西人群中存在TGF-β1基因rs1800469C／T位点多态性，其基因多态性的分布频率差异无统计学意义，但与其他种族人群比较存在显著差异。这种差异可能是导致一些疾病在不同种族人群间临床表现及发病率存在较大差异的因素之一。

TGF-β1；基因多态性；种族

转化生长因子-β1（TGF-β1）是转化生长因子超家族中的一员，是由2条分子量为11KD，有112个氨基酸构成的单链通过二硫键结合而成，分子量为25 Kd的多肽。人类编码TGF-β1的基因位于第19号染色体长臂（19q13.2）上，包含7个外显子和6个内含子。该基因目前已发现的突变位点有十多个，而常见的与疾病有密切联系的有7个，rs1800469C／T（-509C／T）是其中的一个重要的突变位点。该位点位于结构基因5′端上游的DNA序列启动子区内。TGF-β1基因单核苷酸多态性与纤维硬化性疾病、肿瘤性疾病、免疫性疾病和糖尿病及其并发症等疾病的发病密切相关，成为近年来国内外学者研究的热点［1－6］。为此，我们用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术和DNA测序法检测广西人群TGF-β1基因rs1800469C／T位点单核苷酸多态，同时探讨其基因多态性在正常人群间的分布差异，为与TGF-β1基因相关的疾病和遗传学及预防医学等方面的研究提供一些前瞻性基础资料。

1 对象与方法

1.1 对象

研究对象共210例，其中男139例、女71例，平均年龄47.9岁±10.1岁，选自2013年1月至2014年8月右江民族医学院附属医院体检人群的随机个体，年龄匹配，血脂、血常规和其他生化指标都在参考范围内，心电图检查正常，均排除癌症家族史、肝脏、肾脏、内分泌和心脑血管疾病。所有研究对象均为无血缘关系的广西人群。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取

用EDTA-K2抗凝管采集以上健康体检者静脉血3m L，参照我们已建立的改良碘化钠法［7］提取白细胞基因组DNA，放于－70℃冰箱保存备用。

1.2.2 引物设计与合成

根据TGF-β1基因rs1800469C／T多态性和已知的DNA序列，用在线引物设计网站（http：／／www.yeastgenome.org／cgi-bin／web-primer）设计PCR引物，委托上海天昊生物科技有限公司合成。用于特异性扩增TGF-β1基因包含rs1800469C／T位点碱基的DNA片段的引物，上游引物序列为：5′-CAGACTCTAGAGACTGTCAG-3′，下游引物序列为：5′-GTCACCAGAGA AAGAGGAC-3′。

1.2.3 PCR扩增

TGF-β1 rs1800469C／T的PCR扩增反应体系为20μL，其中含10×PCR缓冲液2.0μL，0.3 mmol／L dNTPs 2.0μL，上、下游引物各1.0μL，模板DNA 1.0μL，TaqDNA聚合酶1.0 U，不足体积用灭菌双蒸水补足至20μL。TGF-β1 rs1800469C／T的循环参数为：94℃预变性反应5m in；94℃变性30 s，63℃复性45 s，72℃延伸45 s，35个循环；72℃延伸8m in。

1.2.4 PCR扩增产物限制性酶切

TGF-β1 rs1800469C／T的扩增产物用2 U Bsu36 I于37℃酶切2 h；全部内切酶均来自英国Biolabs公司。TGF-β1 rs1800469C／T酶切产物于8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，染色后在紫外灯下鉴定结果，并用Bio-Rad自动凝胶成像及分析系统进行成像和分析。为进一步验证结果，我们将PCR产物送上海英俊生物技术有限公司进行DNA序列测定。

1.3 统计分析

基因型和等位基因频率采用直接计数法计算，各组间基因型及等位基因频率的比较采用χ2检验，所有数据计算和比较均在SPSS 11.5软件上完成。以P＜0.05作为差异具有统计学意义的参考。

2 结果

2.1 TGF-β基因rs1800469C／T位点基因型检测结果

TGF-β1基因rs1800469C／T位点PCR扩增产物片段大小为419 bp，根据限制性内切酶Bsu36 I酶切片段的情况基因型有3种，CC型（229 bp，190 bp 2条带），CT型（419 bp，229 bp，190 bp 3条

带），TT型（419 bp 1条带）；PCR扩增产物及酶切产物电泳结果分别如下图1和图2。基因测序进一步证实我们的结果（图3）。

图1 TGF-β1基因rs1800469C／T位点PCR扩增产物8％的聚丙稀酰胺凝胶电泳结果Figure 1 PCR amplified products of TGF-β1 gene rs1800469C／T in 8％polyacrylamide gel electrophoresis

2.2 广西人群TGF-β1基因rs1800469C／T位点基因型和等位基因在男、女组间分布频率的比较

计算广西健康人群中TGF-β1基因和等位基因频率，经χ2检验，TGF-β1基因rs1800469C／T位点基因型及等位基因频率符合Hardy-Weinberg遗传平衡，说明所选的研究样本具有群体代表性。在广西人群中TGF-β1基因rs1800469C／T位点基因型以CT型最为常见，占49.5％，其次为TT基因型。等位基因型频率以T最高，占51.0％。其基因型和等位基因频率分布在男女组间比较差异无统计学意义（P＞0.05，P1＝0.941，P2＝0.942。P1和P2分别表示男女间基因型和等位基因频率比较的P值），结果如下表1。

图2 TGF-β1基因rs1800469C／T位点多态性8％的聚丙稀酰胺凝胶电泳结果Figure 2 TGF-β1 gene rs1800469C／T polymorphism in 8％ polyacrylam ide gel electrophoresis

图3 TGF-β1基因rs1800469C／T位点测序图Figure 3 Sequencingmap of TGF-β1 gene rs1800469C／T

表1 广西人群TGF-β1基因rs1800469C／T位点基因型和等位基因在男、女间分布频率的比较（％）Table 1 Comparison of the frequency of genotype and allele distribution of TGF-1 gene rs1800469C／T betweenmale and female（％）

2.3 TGF-β1基因rs1800469C／T位点基因多态性在不同种族人群间的比较

广西人群中TGF-β1基因rs1800469C／T位点基因型和等位基因频率与英国人［8］、土耳其人［9］、欧洲人和非洲人比较，差异均有统计学意义（P＜0.05，基因型和等位基因频率比较P值均小于0.001），但与日本人（P1＝0.335，P2＝0.222）、北京汉

族人（P1＝0.176，P2＝0.135）、福州人［10］（P1＝0.629，P2＝0.333）和重庆汉族人［11］（P1＝0.475，P2＝0.470）比较，差异均无统计学意义（P＞0.05。P1和P2分别表示广西人群与不同国家和地区人群间基因型和等位基因频率比较的P值）。结果如下表2。

表2 不同种族和地区人群间TGF-β1基因rs1800469C／T位点基因型及等位基因频率的比较（％）Table 2 Comparison of the frequency of genotype and allele distribution of TGF-1 gene rs1800469C／T between different races and regions（％）

3 讨论

分子生物学研究发现，基因多态是一种普遍的现象。随着分子生物学技术的日新月异，人们对基因多态的认识有了突破性的进展，基因多态性的研究逐渐成为解释人体对某些疾病或毒物的易感性与耐受性，疾病临床表现的多样性以及对药物治疗的反应性的内在机制。而在我们研究致病基因多态性分布之前，我们应该首先了解其在正常人群中的分布特点，这对我们探索某些致病基因和易感基因的分布特点，研究疾病的发病机理以及其在基因水平的诊断和治疗上都有重要意义。

转化生长因子-β1（TGF-β1）是转化生长因子超家族中的一员，广泛表达于多种细胞表面，包括活化的T细胞、B细胞和多数肿瘤细胞等细胞表面。TGF-β1可以通过调节淋巴细胞的增殖、分化，抑制NK细胞的增殖及杀伤等方式起到免疫抑制作用，这对于机体维持免疫内环境的稳定有着重要作用。然而，在病理情况下，TGF-β1通过其免疫抑制作用，损伤机体的免疫监督功能，使机体失去对自身抗原、肿瘤相关抗原和外来抗原的正常免疫应答，从而导致自身免疫性疾病或肿瘤的发生［12］。人类编码TGF-β1的基因位于第19号染色体长臂（19q13.2）上，包含7个外显子和6个内含子。分子生物学研究表明，TGF-β1基因存在rs1800469C／T位点单核苷酸多态性，这些基因多态性的存在可能影响TGF-β1基因的功能，从而可能导致与之相关疾病的发生和发展。TGF-β1基因存在多个单核苷酸多态性位点，国内外相关研究［1－6］发现，这些多态性位点与纤维硬化性疾病、肿瘤性疾病、免疫性疾病和糖尿病及其并发症等疾病的发生和发展有着密切联系，而rs1800469C／T是其中一个重要位点。因此，正确分析TGF-β1基因多态性在不同民族、国家和地区正常人群中的分布非常必要，其研究成果将为我们今后研究不同人群TGF-β1基因多态性和某些疾病的发生与发展之间的关系提供基础理论依据和分子生物学及遗传学基础。

为此，我们采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术和DNA测序法检测广西地区正常人群TGF-β1基因rs1800469C／T位点多态性的分布情况。结果，在广西人群中，TGF-β1基因rs1800469 C／T位点表现出CC、CT、TT三种基因型，频率分别为24.3％、49.5％、和26.2％；等位基因C、T频率分别为49.0％和51.0％。其基因型和等位基因频率分布男女组间比较，差异无统计学

意义（P＞0.05）。进一步将检测结果同英国人［8］、土耳其人［9］、欧洲人、非洲人、日本人、北京汉族人、福州人［10］和重庆汉族人［11］比较发现，广西人群TGF-β1基因rs1800469C／T位点基因型和等位基因频率与英国人、土耳其人、欧洲人和非洲人比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05），与日本人、北京汉族人、福州人和重庆汉族人比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。而且广西人群TGF-β1基因rs1800469C／T位点T等位基因频率（51.0％）显著高于英国人（32.0％）、欧洲人（28.8％）和非洲人（20.8％）。从本文结果可以发现，TGF-β1基因rs1800469C／T位点基因型和等位基因频率在不同种族间比较，存在着明显的差异，而与同一种族不同人群比较差异较小。这一结果符合“亲缘关系越近，其基因型分布越相似，反之则差异越显著”的遗传学规律。

总之，研究我国广西人群中TGF-β1基因多态性的分布，不仅为今后进一步研究我国广西人群TGF-β1基因多态性与相关疾病发生和发展之间供理论依据，而且，将有助于我们更深入地理解这些疾病在广西人群的遗传基因背景，为后续的群体遗传学和预防医学研究提供前瞻性资料。

[1]Mohy A,Fouad A.Role of transform ing grow th factorβ1 in serum and-509 C＆gt;T promoter gene polymorphism in development of liver cirrhosis in Egyptian patients[J].Meta Gene,2014,9(2):631－637.

[2]Li Z,Zhang L,He W,et al.Astragalusmembranaceus inhibits peritoneal fibrosis viamonocyte chemoattractant protein(MCP)-1 and the transform ing grow th factor-β1 (TGF-β1)pathway in rats submitted to peritoneal dialysis[J].IntMol,2014,15(7):12959-12971.

[3]M iao ZF,LiWY,Wang ZN,et al.Lung cancer cells induce senescence and apoptosis of pleural mesothelial cells via transforming grow th factor-beta1[J].Tumour Biol,2015,36(4):2657-2665.

[4]Tas F,Yasasever CT.Serum transform ing grow th factorbeta1 levelsmay have predictive and prognostic roles in patients w ith gastric cancer[J].Tumour Biol,2015,36 (3):2097-2103.

[5]朱强,朱明华,罗俊,等.IL-10和TGF-β1在系统性红斑狼疮患者血清中的表达及意义[J].军事医学,2015, 39(4):276-278.

[6]Olivieri A,De Angelis S,Dionisi S,et al.Serum transform ing grow th factorβ1 during development in nonobese diabeticmice and humans[J].Clin Exp Immunol, 2010,162(3):407-417.

[7]吴成将,陈健明,蓝艳,等.广西壮族及汉族人群CD40配体基因rs7050168G/A遗传多态性[J].分子诊断与治疗杂志,2015,7(1):9-13.

[8]Bayat A,Watson JS,Stanley JK,et al.Genetic susceptibility in Dupuytren's disease.TGF-beta1 polymorphisms and Dupuytren's disease[J].JBone Joint Surg Br,2002, 84(2):211-215.

[9]Kanra AR,Tulgar-Kinik S,Verdi H,et al.Transforming grow th factor-beta1(509 C/T,915 G/C,869 T/C)polymorphisms are not related to obesity in Turkish children [J].Turk JPediatr,2011,53(6):645-650.

[10]Zheng WX,Yan CH,Wang XH,et al.The TGF-β1 Functional Polymorphism rs1800469 and Susceptibility to Atrial Fibrillation in Two Chinese Han Populations [J].Plos One,2013,8(12):e83033

[11]裴芳,黄骥,黄婕,等.TGF-β1基因启动子区-509C/T多态性与重庆汉族人群冠心病及其危险因素的相关性[J].中国动脉硬化杂志,2014,22(9):936-944.

[12]Li MO,Wan YY.Transform ing grow th factor-beta regulation of immune responses[J].Annu Rev Immunol, 2006,24:99-146.

The genetic polymorphism of TGF-β1 gene rs1800469C/T in Guangxipopulations

HUANG Huatuo,LUO Hongcheng,XIANG Yang,CHEN Jianming,WU Chengjiang,WEIYesheng★
(Department of Laboratory Medicine,Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities, Baise,Guangxi,China,533000)

Objective Based on the study of the frequencies of allele and genotype distribution of TGF-β1 gene rs1800469C/T polymorphism in Guangxi populations,to analyze the distributions of TGF-β1 rs1800469 C/T polymorphism among different races.Methods The TGF-β1 gene rs1800469C/T polymorphism was exam ined by the polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism methods in 210 Guangxi populations and compared w ith other ethnics.Results The TGF-β1 gene rs1800469C/T showed three genotypes of CC,CT,TT,and the frequencies were 24.3％,49.5％and 26.2％,respectively. Its allele frequencies of C and T were 49.0％and 51.0％,respectively.The frequencies of allele and genotype distribution of TGF-β1 gene rs1800469C/T were no statistical significance between men and women in Guangxi populations(P＆gt;0.05).Compared w ith British,Turks,HapMap-CEU and HapMap-YRI populations, the TGF-β1 gene rs1800469C/T polymorphism were in statistical significance(P＆lt;0.05).But compared with HapMap-JPT,HapMap-HCB,Fuzhou and Chongqing Han populations,there were no statistical significance (P＆gt;0.05).Conclusion There are TGF-β1 gene rs1800469 C/T polymorphism in Guangxi populations,and its distributions has no statistical significance between men and women in Guangxi populations.Whose distri-

TGF-β1；Polymorphism；Ethnic

国家自然科学基金（81260234，81060243，81560552）

右江民族医学院附属医院检验科，广西，百色533000

★通讯作者：韦叶生，E-mail：wysh22＠163.com

butions are significant difference compared w ith others ethnic populations.The variation of TGF-β1 gene polymorphism among different ethnic groupsm ight account for the varied clinical spectrum of some TGF-β1 gene related diseases.