柳州市2014年手足口病实验室检测结果分析

许泽辉罗世强王敬仁蔡鹏飞覃肖唐宁★

·论著·

柳州市2014年手足口病实验室检测结果分析

许泽辉1，2罗世强1，2王敬仁1，2蔡鹏飞1，2覃肖1，2唐宁1，2★

目的明确柳州地区手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）病毒的主要感染病毒型别及流行特征，为手足口病防治提供科学依据。方法收集2014年1月至2014年12月6 667例疑似手足口病感染者。运用实时荧光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）方法，对肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）和柯萨奇肠道病毒16型（coxsackievirus A16，CoxA l6）特异性进行核酸检测。结果6 667例患者标本中，EV71阳性数为1 310例，阳性率为19.65％，CoxA16阳性数为858例，阳性率12.87％。EV71和CoxA16合并感染阳性数为11例，阳性率为0.16％。男性人群手足口病发病率高于女性，4月～9月份为发病高峰。结论柳州市2014年手足口病主要致病病毒为EV71、CoxA16，基因分型对手足口病临床诊治及疾病爆发的预防有一定指导意义。

手足口病；病毒核酸；流行特征；防控措施

由肠道病毒（enterovirus，EV）引起的手足口病（hand，footandmouth disease，HFMD）是一种儿童期常见传染病。该病于5岁以下儿童好发，大多数患儿症状较轻，表现为低热、厌食、口痛及手、足、口腔等部位出现小溃疡或小疱疹。少数患儿会出现心肌炎、无菌性脑膜炎、肺水肿等并发症。若病情发展快，可导致个别重症患儿死亡。目前为止已有20多种（型）的肠道病毒可引发手足口病，最为常见的是肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）和柯萨奇病毒A16型（coxsackievirus A16，Cox A16）［1，2］。本文对2014年采集的共6 667例疑似HFMD感染者的咽拭子、粪便或疱疹液标本进行了EV核酸检测，并结合病例临床信息对结果进行分析。

1 对象与方法

1.1 对象

按照《手足口病预防控制指南（2010年版）》要求，采集柳州市妇幼保健院的6 667例疑似HFMD感染者（即发热及手掌、脚掌、股部或口腔黏膜出现疱疹的患者）的咽拭子、粪便、疱疹液标本，其中男性3 846例，女性2 821例，年龄5天至14岁，平均年龄（2.30±0.02）岁。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA核酸提取

采用中山大学达安基因股份有限公司的病毒RNA核酸提取试剂盒进行EV核酸提取，严格按照说明书操作，收集病毒RNA提取液30μL，保存于－20℃备用。

1.2.2 EV核酸检测

采用中山大学达安基因股份有限公司的肠道病毒71型核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）、柯萨奇病毒A16型核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）进行EV17、Cox A16的核酸检测，所用仪器为美国ABI公司ABI 7300型实时荧光定量PCR基因扩增仪。实时荧光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）的反应体系和反应条件参照其操作说明书进行。

1.3 统计学分析

采用SPSS 14.0软件进行统计学分析，计数资料采用χ2检验进行分析，P＜0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 柳州市儿童手足口病的概况

柳州市手足口病全年的流行趋势见表1。EV71在不同季节流行情况的差异有显著意义（χ2＝65.33，P＜0.001），其中以春夏两季最高；Cox A16在不同季节流行情况的差异有显著意义（χ2＝335.03，P＜0.001），其中以冬春两季最高；EV71阳性合并Cox A16阳性的发病情况无季节差异。

对6 667例疑似HFMD感染者标本进行RT-qPCR检测，结果显示EV71型阳性者1 310例，Cox A16阳性者858例，EV71、Cox A16的阳性率分别为19.65％（1 310／6 667）、12.87％（858／6 667），EV71和Cox A16同时阳性者11例，阳性率为0.16％，具体结果见表2。EV71型的阳性检出率显著高于Cox A16的检出率（χ2＝112.53，P＜0.001），部分检测结果见图1。

2.2 人群分布特征

表1 不同季节患儿的EV检出情况Table 1 The detectable rates of the virus subtypes in different seasons

按照不同年龄组进行统计分析，计算其构成

比。按照手足口病病例的年龄（0～、1～、2～、3～、4～、＞5岁）进行分组，在EV71病毒感染组中，不同年龄组发病构成由高到低依次为3～（31.71％）、2～（24.33％）、＞5（23.90％）、4～（22.44％）、1～（17.79％）、0～（9.00％），χ2＝220.20，P＜0.001；在Cox A16病毒感染组中，不同年龄组发病构成由高到低依次为4～（18.05％）、2～（13.79％）、3～（13.02％）、＞5（12.91％）、1～（12.47％）、0～（11.05％），χ2＝15.64，P＝0.008。EV71和Cox A16病毒合并感染主要分布在2岁～5岁的儿童中，具体结果见表2。

图1 EV71、Cox A16基因分型结果Figure 1 The genotyping results of EV71 and Cox A16

表2 不同年龄患儿的EV检出情况Table 2 The detectable rates of the virus subtypes in differentages

2.3 性别分布特征

根据性别对不同病原体进行统计分析，统计结果见表3。EV71在男女患儿中的阳性率均最高，其次为Cox16，EV71合并Cox A16感染的患儿则比较罕见；在EV71、Cox A16病毒感染及EV71阳性合并Cox A16阳性组中，男性人群的手足口病发病率与女性之间的差异无显著意义，说明EV71、Cox A16病毒感染在不同性别的感染情况无差异。

2.4 月份分布特征

2014年手足口病的流行发病时间是4月～9月，5月份最高，达到2 355例；1月、2月、3月、11月和12月发病人数在100以下；4月～9月发病人数为6 338例，占全年的95.06％（图2）。

表3 不同性别患儿的EV检出情况Table 3 The detectable rates of the virus subtypes in differentgenders

图2 不同月份儿童手足口病发病人数趋势Figure 2 Prevalent features of HFMD in differentmonths

2.5 重型病例情况分析

2014年备案的重型中，由EV71引起的有68例，其中危重型4例，重型55例，转为危重9例，而Cox A16引起的重型病例一共5例（3例重型，2例转为危重）。EV71病毒感染导致危重型、重型及转为危重型病之和与Cox A16病毒感染导致危重型、重型及转为危重型病之和存在着明显的差异（P＜0.05），且EV71病毒感染更容易导致重型手足口病，结果见表4。

表4 EV71与CoxA16病毒感染所导致的重型病例分布情况Table 4 Severe HFMD caused by EV71 and CoxA16

3 讨论

手足口病一般由多种肠道病毒共同引起，其中以Cox A16、EV71为主。大多数患者症状轻微，部分病例临床表现不典型，患儿就诊时间早，早期只表现为发热，无皮疹及其他表现，给早期诊断带来困难，易导致误诊，是引起危重手足口发生的重要原因之一［3］。因此对于流行季节的婴幼儿，虽无手足口病的典型表现也要高度怀疑，做进一步实验室诊断，而采用简便、快捷、准确的技术则是实验室诊断的关键［4］。

RT-qPCR是将PCR技术和荧光检测技术结合起来实现了对核酸的自动化检测的技术，其原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用PCR对DNA的高效扩增，运用高特异性的探针和高敏感性的光谱技术检测目的片段及定量。RT-qPCR对病毒的检测极大地缩短了免疫学检测的“窗口期”问题，可以尽早发现病毒携带者，为疾病的预防及诊治提供科学依据。因此荧光定量基因检测方法可准确、灵敏地反映EV感染数量和治疗恢复情况，对EV诊断和疗效的观察具有重要的指导作用［5－8］。

本研究6 667例患者标本中，检测出EV71阳性数为1 310例，阳性率为19.65％；CoxA16阳性数为858例，阳性率12.87％；EV71和CoxA16合并感染阳性数为11例，阳性率为0.16％。结合本地区与国内其他地区的结果说明EV71手足口病最常见的病原体［9］。然而各地EV71和CoxA16占手足口病原体的比例存在差异，Yang和Li等［10－11］报道杭州与武汉等地的EV71和CoxA16病毒感染与本地区的相近，Lu等报道广州地区EV71的感染明显高于本地区［12］。从我们检测结果表明全年均有发病，以夏、秋季为高发季节，5月份病例突然增加，并迅速达最高峰，10月份发病人数开始下降，发病人数主要集中在4月～9月。王春荣和Xu等［13－14］报道济南和云南地区的发病趋势与本地相似，夏季为高发季节，5月～7月是发病高峰期。由此可以推测手足口病的发病与季节有直接的关系，春夏两季是手足口病的发病流行高峰。因此在疾病预防控制上应加强该段时间的监测与控制，做好消毒及疾病预防宣传工作，以防止疾病的暴发流行［4］。本研究男性发病人数多于女性，可能是由于手足口病是由肠道病毒引起的，主要由接触了带有病毒的鼻咽排泄物、粪便和疱疹液而感染。而男孩生性好动，活动范围大，比女孩更容易接触被手足口病患者污染过的物品而感染手足口病。手足口重型病例，主要以EV71感染的为主。EV71感染除了引起手足口病以外，还可能引起严重的神经系统疾病，如脑干脑炎、无菌性脑膜炎和脊髓灰质炎样麻痹等，甚至危及生命，因此在早期检测到EV71阳性的病例，需加强监测，预防病情的加重及并发症的发生［15－18］。

对于婴幼儿而言，其免疫系统发育尚未完全成熟，体内无相应的抗体保护，机体的抵抗力相对较差，容易受到EV的感染［4，17］。因此应加强对婴幼儿特别是5岁以下儿童进行EV病毒检测和分型。EV感染的早期诊断，不仅能防止疾病的进一步恶化，更能避免手足口病在本地区流行性爆发［19］。从我们所做结果来看，RT-qPCR用于肠道病毒的检测，对于疑似手足口病患者，可以做到早诊断、早报告、早隔离和早治疗，能够广泛地运用于各种实验室检测。在柳州市4月～9月份手足口病高发的季节，对于出现发热及手掌、脚掌、股部或口腔黏膜出现疱疹等疑似手足口病临床表现的患者，肠道病毒感染的检测是必不可少的。

[1]Xing W J,Liao Q H,Viboud C,et al.Hand,foot,and mouth disease in China,2008-2012:an epidem iological study[J].Lancet Infect Dis,2014,14(4):308-318.

[2]Zheng S,Cao CX,Cheng JQ,et al.Epidem iological features of hand-foot-and-mouth disease in Shenzhen, China from 2008 to 2010[J].Epidem iol Infect,2014, 142(8):1751-1762.

[3]Ventarola D,Bordone L,Silverberg N.Update on hand-foot-and-mouth disease[J].Clin Dermatol,2015, 33(3):340-346.

[4]Xie YH,Chongsuvivatwong V,Tan Y,et al.Important roles of public playgrounds in the transmission of hand, foot,and mouth disease[J].Epidemiol Infect,2015,143 (7):1432-1441.

[5]Dubot-Peres A,Tan CY,de Chesse R,et al.SYBR green real-time PCR for the detection of all enterovirus-A71 genogroups[J].Plos One,2014,9(3): e89963.

[6]Tan EL,Yong LL,Quak SH,et al.Rapid detection of enterovirus 71 by real-time TaqMan RT-PCR[J].JClin Virol,2008,42(2):203-206.

[7]Wang D,Wang X,Geng Y,et al.Detection of enterovirus 71 gene from clinical specimens by reversetranscription loop-mediated isothermal amplification[J]. Indian JMed M icrobiol,2014,32(2):124-129.

[8]Zhang S,Wang J,Yan Q,et al.A one-step,triplex,real-time RT-PCR assay for the simultaneous detection of enterovirus 71,coxsackie A16 and pan-enterovirus in a single tube[J].Plos One,2014,9(7):e102724.

[9]Liu SL,Pan H,Liu P,et al.Comparative epidem iology and virology of fatal and nonfatal cases of hand,foot and mouth disease in mainland China from 2008 to 2014[J].Rev Med Virol,2015,25(2):115-128.

[10]Yang Q,Ding J,Cao J,et al.Epidem iological and etiological characteristics of hand,foot,and mouth disease in Wuhan,China from 2012 to 2013:outbreaks of coxsackieviruses A10[J].J Med Virol,2015,87(6): 954-960.

[11]LiW,Zhang X,Chen X,et al.Epidemiology of childhood enterovirus infections in Hangzhou,China[J].Virol J,2015,12(1):58.

[12]Lu J,Zeng H,Zheng H,et al.Hand,foot and mouth disease in Guangdong,China,in 2013:new trends in

the continuing epidemic[J].Clin M icrobiol Infect,2014, 20(7):O442-O445.

[13]王春荣,关恒云,韩秀云,等.2009-2013年济南地区重症手足口病病原学及流行病学分析[J].实用预防医学,2015,22(01):60-62.

[14]Xu W,Jiang L,Thammaw ijaya P,et al.Hand,foot and mouth disease in Yunnan province,China,2008-2010[J].Asia Pac J Public Health,2015,27(2):769-777.

[15]Wang SM,Liu CC.Update of enterovirus 71 infection: epidem iology,pathogenesis and vaccine[J].Expert Rev Anti Infect Ther,2014,12(4):447-456.

[16]Wang Q,Zhang W,Zhang Y,et al.Clinical features of severe cases of hand,foot and mouth disease with EV71 virus infection in China[J].Arch Med Sci,2014, 10(3):510-516.

[17]Nguyen NT,Pham HV,Hoang CQ,etal.Epidem iological and clinical characteristics of children who died from hand,foot and mouth disease in Vietnam,2011[J]. BMC Infect Dis,2014,18(14):341.

[18]王琼珠,范长玲.白细胞介素2基因多态性与手足口病EV71脑炎患者的关联性分析[J].分子诊断与治疗杂志,2014,6(1):26-29.

[19]Ang LW,Tay J,Phoon MC,et al.Seroepidem iology of coxsackievirus A6,coxsackievirus A16,and enterovirus 71 infections among children and adolescents in Singapore,2008-2010[J].Plos One,2015,10(5): e0127999.

Analysis of the laboratory diagnosis results of hand-foot-mouth disease in 2014 in Liuzhou city

XU Zehui1,2,LUO Shiqiang1,2,WANG Jingren1,2,CAIPengfei1,2,QIN Xiao1,2,TANG Ning1,2★
(1.Department of Clinical Laboratory,Liuzhou Maternal and Child Care Hospital,Liuzhou,Guangxi,China, 545001；2.Liuzhou Key Laboratory of Birth Disease Prevention and Control,Liuzhou,Guangxi,China, 545001)

Objective To study the virus subtypes of hand-foot-mouth disease(HFMD)and prevalent features so as to provide scientific basis for the surveillance and control of HFMD.Methods A total of 6 667 specimens were collected from January to December in 2014.Nucleic acid in genotype of enterovirus 71(EV71)and coxsackievirus 16(CoxA16)were detected by real-time quantitative PCR(RT-qPCR).Results 1 310 cases(19.65％),858 cases(12.87％)and 11 cases(0.16％)were positive for EV71, CoxA16 and EV71 combined w ith CoxA16,respectively.Male’smorbidity was higher than that of female’s, and peaks of incidence occurred from April to September.Conclusion EV71 and CoxA16 are the main pathogenic viruses of HFMD in Liuzhou in 2014.Genetic analysis has profound guiding significance for HFMD diagnosis and outbreaks prevention.

Hand-foot-mouth disease；Viral nucleic acids；Prevalent features；Surveillance and controlmeasures

柳州市科学研究与技术开发计划项目（2014G020404）

1.柳州市妇幼保健院检验科，广西，柳州545001 2.柳州市出生缺陷预防与控制重点实验室，广西，柳州545001

★通讯作者：唐宁，E-mail：tn825＠126.com