川芎嗪对甘油注射小鼠骨髓细胞转化修复肾小管损伤的影响

房振宇，刘永梅，王全胜

(安徽医科大学附属巢湖医院肾内科，安徽巢湖 238000)

急性肾小管坏死(acute tubuLar necrosis，ATN)是一种临床常见的疾病，是急性肾功能衰竭的重要原因，ATN发生的主要原因是肾脏局部的缺血损伤。骨髓干细胞是体内重要的一类组织干细胞，研究表明骨髓干细胞能分化成肾小球细胞［1-2］。重症不可逆ATN不能恢复的主要原因是由于损伤区域残存小管细胞的自身修复能力差，如果从骨髓来源的细胞转化增多，成为修复的主力，势必改善重症ATN的预后。然而，骨髓干细胞转化为肾小管细胞的数量有限，转化效率也不甚理想。

研究发现一些中药对骨髓干细胞可能有重要的影响［3-4］，川芎嗪促进骨髓干细胞的增生，使得进入血循环中的骨髓干细胞增多，理论上发生转化的骨髓干细胞也增多，而这正有利于ATN肾小管上皮细胞的恢复。基于以上的研究基础，我们推测川芎作为干细胞分化，增殖的调控手段，对于骨髓干细胞在受体肾脏的分化将会起到积极的作用，可加速病变肾小管的修复。

1 材料与方法

1.1 材料和制剂

1.1.1 实验动物 4～6周龄(体重18～22 g)绿色荧光蛋白标记的转基因雄性C57BL/6小鼠35只为骨髓供体(美国匹兹堡大学肿瘤研究中心程涛教授惠赠)，6～8周龄(体重18～22 g)清洁级C57BL/6小鼠60只(购自第二军医大学实验动物中心)。

1.1.2 试剂 兔抗GFP多抗(Abcam公司)生物素标记的羊抗兔二抗试剂盒(Labvision公司)20%川芎嗪(上海第二军医大学长海医院自制)GM-CSF(特尔立)厦门特宝生物工程有限公司(批号:20031027)。

1.1.3 分组 60只清洁级雌性C57BL/6小鼠，施行骨髓移植及缺血再灌注手术后随机分成3组。(1)骨髓移植+甘油注射组:给予60Co照射后进行骨髓移植，于移植后8周进行甘油注射，于注射后持续1周使用0.9%生理盐水注射，20只。(2)骨髓移植+甘油注射+20%川芎嗪组:给予60Co照射后进行骨髓移植，于移植后8周进行甘油注射，于注射后持续1周使用20%川芎嗪干预，20只。(3)骨髓移植+甘油注射+GM-CSF组:给予60Co照射后进行骨髓移植，于移植后8周进行甘油注射，于注射后持续1周使用GM-CSF干预，20只。

1.2 实验方法及步骤

1.2.1 骨髓有核细胞的提取 用酒精(75%)将GFP标记使用脱臼方法处死的C57BL/6小鼠浸泡约5～10 min。随后在无菌条件下分离出小鼠的胫骨和股骨，分别剪去两端的骨皮质。将小鼠的胫骨和股骨用7号针头以LG-DMEM(低糖型 DMEM(GIBCOBRL公司产品)约1 mL冲出骨髓后，将冲出的骨髓液依次经过7号和4号针头吹打，再经过钢筛过滤成单细胞悬液。此单细胞悬液使用红细胞裂解液在4°C下裂解10 min，再使用PBS(0.01 mmol·L-1pH7.4磷酸盐缓冲液)洗涤成骨髓有核细胞。得到的骨髓有核细胞再次使用含10%FBS(胎牛血清)的LG-DMEM重悬成单细胞悬液。最后检查骨髓有核细胞活力(要求细胞活力在95%以上)。

1.2.2 骨髓移植 在移植前5 d用含红霉素(250 mg·L-1)的抗生素溶液给受体鼠服用进行肠道准备。移植时使用特制的表面多孔的塑料盒，将小鼠置入其中，让其全身均匀接受60Co照射(总剂量7.5 Gy)，照射后6 h内，将供体小鼠骨髓有核细胞以1 mL注射器25号针头经尾静脉按每只每0.2mL含有2×106个细胞注射。此后将受体小鼠移入超净台(附带空气过滤帽的塑料透明鼠盒)，使用60Co照射消毒后的食物，高压消毒的饮水(测定pH 3～5)喂养，并饮用含红霉素的抗生素溶液2周。

1.2.3 肌肉注射甘油诱导ATN模型 在接受注射前18 h到注射后8 h内不给予实验小鼠饮水，增加甘油毒性。将甘油(纯度＞98%)用双蒸水稀释至50%，按预实验摸索的最佳剂量7.5 mL·kg-1，于小鼠双侧后肢肌肉各予以1/2剂量注射。

川芎嗪及GM-CSF的具体使用方法如下:(1)1组0.9%生理盐水0.2 mL每天;(2)2组20%川芎嗪2 mg·kg-1每天;(3)3组 GM-CSF 10μg·kg-1每天。

1.3 标本处理及观察

1.3.1 血常规，肌酐，尿素氮检测 以2% 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，心脏穿刺取血，将20μL小鼠血液置于EDTA抗凝的Ependoff管中，血细胞分析仪检测血液常规。1 mL血液，静置30 min，3 000 r·min-1离心30 min后收集血清，Beck自动生化仪检测血清尿素氮，血清肌酐。

1.3.2 病理切片 脱臼处死小鼠，取肾脏组织，在10% 中性福尔马林浸泡固定，常规脱水、浸蜡并包埋。常规制备石蜡肾组织切片。HE染色。光镜下观察病变，同时采用Vyacheslav等的半定量方法评估肾小管损伤程度。肾小管损伤定义为:肾小管坏死或刷状缘脱落、管型形成、管腔扩张，每张切片至少计数10个视野(200倍)。按受损小管比例评分:0.无病变;1.≤10%;2.11% ～25%;3.26% ～45%;4.46% ～75%;5.＞76%。

1.3.3 冰冻切片 以2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，开胸，心脏穿刺取血，先用100 mL 0.01 mmol·L-1磷酸盐缓冲液(PB，pH7.3)经心脏冲洗血液，再用500 mL含4%多聚甲醛0.1 mmol·L-1磷酸盐缓冲液(PB，pH7.3)灌注固定。灌毕立即取双侧肾脏标本并置于上述相同的固定液中后固定4 h(4°C)，然后移入含25%蔗糖的0.1 mmol·L-1的PB中，4℃过夜。冷冻连续切片，片厚5μm。切片分2套，分别进行免疫组织化学染色，荧光显微镜观察。

1.3.4 免疫组织化学方法检测GFP表达 石蜡肾组织切片(4μm)58℃烘干，18 h，常规脱蜡至水，使用3%H2O2抑制内源性过氧化物酶，将切片置于预加热到 98℃，pH6.0，0.01 mol·L-1柠檬酸缓冲液中，微波Ⅲ档(98℃)，20 min，自然冷却到室温进行抗原修复，PBS洗3 min×3，加GFP一抗(鼠)1∶500 4℃过夜，PBS洗 3×3 min。b-SAR IgG 1∶200，37℃，30 min。PBS 洗 3 min ×3，S-HRP 1∶400，37℃，30 min，PBS 洗3 min ×3。0.4%DAB+0.03%H2O2显色 12 min，水洗，苏木精衬染，常规树酯封片。

2 结果

2.1 一般情况 实验过程中死亡12只，2只因麻醉死亡，4只因取血死亡，6只因注射甘油及骨髓移植死亡。

剩余动物1组15只，2组15只，3组18只。

2.2 血肌酐尿素氮 使用生理盐水、川芎嗪、GMCSF在注射后7 d血肌酐、尿素氮有一过性升高，28 d血肌酐尿素氮无明显变化。见表1。

表1 尿素氮、肌酐在3组中的变化

2.3 血常规 1、2组在手术后7、28 d内白细胞、红细胞均未见明显变化。3、4组在术后7 d白细胞、红细胞增加，28 d恢复1、2组水平。见表2。

表2 白细胞、红细胞在3组中的变化

2.4 流式细胞仪法 骨髓移植后5 d甘油注射后14 d，流式细胞仪法测骨髓中 GFP(+)细胞数目，见表3。2、3组其 GFP(+)骨髓细胞数占的比率较1组有升高。

表3 GFP阳性细胞在骨髓细胞中的比率/%

2.5 病理切片 骨髓移植行后甘油注射后予以生理盐水(A)，川芎嗪(B)，GM-CSF(C)，第 14、28 天的肾脏缺血侧(L)的HE染色(图1)HSK评分:第14天时肾脏A组与B组损伤差异明显，C组显示坏死较A组好转，但炎细胞和间质细胞增多。B组的变化较其余各组更明显，基本无损伤表现，其它各组损伤也恢复(表4)。

表4 各组的HSK积分

2.6 荧光显微镜 骨髓移植后进行甘油注射，之后予以生理盐水(A)，川芎嗪(B)，GM-CSF(C)。干涉第14天，GFP荧光在各组的显示，透视象表现及叠加象表现(图2)。

2.7 免疫组化 骨髓移植后行甘油注射，之后予以生理盐水(A)，川芎嗪(B)，GM-CSF(C)第14天，28天GFP阳性细胞的分布(图3)，计数GFP阳性细胞占肾小管上皮细胞的比率(表5)。

3 讨论

近年来随着对骨髓间充质干细胞的研究的逐渐深入，其参与体内许多器官的修复的特性正在被越来越关注［5］。但这种研究与临床的需求还有很大的差距，其参与修复的数量及效果也远远达不到临床所需求的标准，因此对于是否能通过促进骨髓增殖的手段达到提高骨髓干细胞参与受损器官修复的数量，正日益受到广泛的关注［6］，两项国内的研究也曾使用肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor)及粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员骨髓干细胞促进修复大鼠的急性肾损伤［7-8］。

我们的研究结果表明，甘油注射引起的急性肾小管坏死后，肾功能的变化是一过性的，川芎嗪或GM-CSF的使用，也并无明显对肾功能变化的影响。单纯使用川芎嗪的促骨髓细胞增殖并转化为外周血细胞的效果并不是很明显，GM-CSF对于外周血象的影响是一个短暂的骨髓动员的过程。流式细胞仪的结果可以看出川芎嗪及GM-CSF对于供体骨髓细胞的增殖是由促进作用的，即使用后供体骨髓细胞所占总骨髓细胞的比率较对照组上升。病理切片以及组织学评分:首先，川芎嗪对于肾小管损伤肾脏的修复有一定的促进作用，可以看到坏死范围缩小，细胞数目增多，修复的程度，速度均较对照组有升高。而使用GM-CSF的组能看到坏死范围缩小，细胞数目的增多。但同时炎细胞及间质细胞的数目也较对照组有增多，因此我们觉得川芎嗪对于急性肾小管坏死的修复有促进作用，其促进作用的发挥可能也与川芎本身改善肾脏微循环，修复肾损伤的作用有关，而GM-CSF对于急性肾小管坏死的修复造成的影响，目前看来是有利有弊的，具体发生机制还需要进一步分析。荧光显微镜为我们提供了一些川芎嗪和GM-CSF在骨髓干细胞转化为肾小管上皮细胞中所起到的作用的一些初步的证据，根据大体的观察，我们能够看到，川芎嗪组和GMCSF组绿色荧光较对照组增多。而使用免疫荧光做进一步计算机图形计数，通过免疫荧光的照片，能发现川芎嗪和GM-CSF组较对照组的外源性肾小管上皮细胞均有一定的升高。

近年来有研究通过改变骨髓移植的时间点来观察骨髓干细胞对肾小管损伤修复的影响，认为早期移植效果较好，急性肾损伤发生4～8周时效果最佳［8-9］，我们的实验则通过一些促骨髓增殖的因素，增加循环中骨髓干细胞的数目，最终也观察骨髓干细胞向肾小管分化的量的增多。首先证实了骨髓干细胞可以转化为肾小管上皮细胞，进一步支持了以前各类相关研究得出的结论，其次反映了中药川芎嗪通过对骨髓的增殖作用，促进了骨髓干细胞对肾小管上皮细胞的转化。但有研究曾得出结论认为大部分分化到修复受损的小管细胞来自于内源性的细胞群，而不是骨髓衍生的细胞。还有研究认为骨髓间充质干细胞主要通过旁分泌的机制修复了肾小管损伤［10］。体外研究也显示骨髓干细胞可以修复肾小管损伤但不能预防急性肾损伤的发生［11］，因此是否我们这里得出的外源性肾小管细胞还存在其他的来源和形式，修复这些受损的肾小管时，川芎嗪和GM-CSF这些促骨髓增殖因素是否有通过其他细胞因子或者旁分泌模式达到总体修复肾小管急性损伤，增加外源性有功能的肾小管上皮细胞可能是我们需要继续探讨的目标。同时此类研究也探讨了对使用骨髓干细胞减少慢性肾损伤肾间质纤维化的可能［12］，当然川芎嗪及 GMCSF是否也能促进这些作用也需要继续研究。

总之，通过我们的研究，我们可以证实川芎嗪和CM-CSF均可一定程度的增加骨髓干细胞对于肾小管急性损伤的修复作用。至于其修复机制是否存在其他因素影响以及其他作用大小仍需继续研究。

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