左西孟旦对犬体外循环术后肺保护的实验研究

王纪源，葛圣林，冯俊波

(安徽医科大学第一附属医院心脏外科，安徽合肥 230022)

体外循环(cardiopulmonary bypass，CPB)技术的诞生和发展使得许多心脏手术得以开展，但体外循环术中肺组织由于全身炎症反应及缺血再灌注而受到损伤，导致肺功能下降，甚至导致急性呼吸窘迫症，严重影响了患者的临床转归，且死亡率较高［1］。最新研究发现左西孟旦(LS)作为新一代钙增敏剂具有脏器保护作用，本实验通过建立实验用杂种犬体外循环模型，对左西孟旦对体外循环术后的肺保护作用进行初步研究探讨。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物:健康杂种犬32只，雌雄不拘，体质量(12±1.94)kg，由安徽医科大学动物实验中心提供。

主要试剂及仪器:LS(山东齐鲁制药公司，批号:411006f3);丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);小动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司);-80℃低温冰箱(日本三洋公司);光学显微镜(CX 40型，日产Olympus);Sarns5000型人工心肺机(美国);电子显微镜(日产日立公司);BS 110S型电子天平(德国Sartorius公司);JHF1-DHG-9076A型恒温电热鼓风干燥箱(北京中西泰安技术服务有限公司);WI313182型血气分析仪(东西仪北京科技有限公司);CPB配套管，CPB插管，气管插管等。

1.2 方法

1.2.1 动物模型复制 实验犬术前禁食8～12 h，静脉注射戊巴比妥钠(30 mg·kg-1)，待麻醉完全起效后，对犬进行气管内插管，连接小动物呼吸机，设置呼吸机潮气量、氧浓度、呼吸频率分别为12 mL·kg-1、45%、每分钟25次。辅助呼吸后，股动脉穿刺并置测压管连接监护仪，观察犬的生命体征状况;胸骨正中切口，充分止血后切开心包，暴露心脏，在主动脉根部及右心耳处分别插管，建立CPB。开始CPB后，逐步进行降温至30℃时阻断钳阻断升主动脉，主动脉根部插入灌注针，通过灌注针灌注心脏停搏液使心脏完全停搏后置冰泥保护心肌，同时停止机械通气，每半小时灌注一次，主动脉阻断持续1 h，再行升主动脉开放2 h，主动脉开放后立即恢复机械通气，CPB辅助，待血流动力学完全恢复稳定后再逐渐停止CPB。

1.2.2 实验分组 实验用动物杂种犬32只随机分为四组:(1)C组:开胸后常规建立体外循环，体外循环过程中不做特殊处理;(2)P组:于主动脉阻断后经肺动脉灌注低温氧和血(氧和血引自氧和器，经冰水槽浴，保持氧和血温度在0～4℃左右)，肺动脉灌注流量40～50 mL·kg-1·min-1)，灌注压30 mmHg左右，灌注液量30～45 mL·kg-1，灌注时间控制在8～10 min;(3)LSIV组:于犬麻醉后静脉注射LS(65 g·kg-1)，至主动脉阻断前注射完毕;(4)LSP组:主动脉阻断后经肺动脉灌注含LS(65 g·kg-1)的低温氧和冷血，具体灌注方法同P组。

1.2.3 标本的采集和处理 待实验完成后，高钾注射处死实验犬，取出右肺组织，用4℃盐水冲洗肺组织并用滤纸吸干表面水分。取中段肺组织约0.3 g放入10%福尔马林溶液固定24 h后，取出肺组织，石蜡包埋、切片、苏木精—伊红(HE)染色，在光镜下的观察肺组织的形态并拍摄照片;取下段0.8 mm ×0.8 mm ×0.8 mm 大小的肺组织置于 2.5%戊二醛溶液中固定，完成后对肺组织进行切片通过电镜观察肺组组形态并拍摄照片。剩余肺组织于冻存管中放置后在放入-80℃冰箱冻存，留作标本测定。

1.2.4 肺组织MDA含量及SOD活性测定 取冻存的肺组织按试剂盒要求制备组织匀浆液，应用硫代巴比妥酸(TBA)反应法测定肺组织中MDA的含量及应用化学比色法测定肺组织中超氧化物歧化酶(SOD)的活性(测定过程严格按照试剂盒说明操作)。

1.3 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，经方差齐性检验后，各组计量资料的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，P＜0.05认为组间显著性差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织中MDA含量及SOD活性 与C组相比，LSP组、P组及LSIV组MDA含量均明显降低，且SOD活性明显升高(P＜0.01)，与LSP组相比，LSIV组及P组MDA含量明显升高，且SOD活性明显降低(P＜0.01)，P组和LSIV组比较无统计学意义(P ＞0.05)，见表1。

表1 各组MDA含量及SOD活性(±s)(n=8)

表1 各组MDA含量及SOD活性(±s)(n=8)

注:多重比较:与C组相比，＊＊P＜0.01，与LSP组相比，##P＜0.01。

组别 MDA含量(nmol/mgprot) SOD活性(U/mgprot)C组64.22 ±7.35 108.38 ±12.27 P 组 22.06 ±3.85＊＊## 197.74 ±16.33＊＊##LSIV 组 20.33 ±3.04＊＊## 207.18 ±18.65＊＊##LSP 组 6.54 ±1.08＊＊ 307.53 ±23.10＊＊F 219.460 142.973 P ＜0.01 ＜0.01

2.2 肺组织光学显微镜形态变化 光镜下可见C组细胞间质水肿，炎细胞浸润，有大量的红细胞，炎性细胞、浆液性渗出液在肺泡腔内。肺泡结构基本被破坏，有一部分塌陷，还有部分完全消失，在消失的肺泡内，可发现代偿性肺气肿。P组和LSIV组肺组织也有肺泡间质水肿，但较C组均明显减轻，肺泡内炎细胞浸润及出血、渗出都有所减少，组织损伤程度明显较轻，LSP组肺泡间隔水肿程度最轻，肺泡内仅有少许渗出物，炎症细胞浸润程度较其余几组也明显减轻(图1)。

2.3 肺组织电子显微镜形态变化 电镜下C组Ⅱ型上皮细胞线粒体肿胀明显，体积增大，线粒体基质电子密度降低，脊紊乱消失，板层小体排空明显，细胞膜上微绒毛减少，部分细胞核呈多形性。LSIV组和P组Ⅱ型上皮细胞线粒体轻度肿胀，嵴排列稍紊乱，板层小体空泡化稍减轻，胞膜上微绒毛稍减少，细胞核多呈椭圆形。LSP组Ⅱ型上皮细胞线粒体肿胀程度最轻，嵴排列紊乱程度也明显减轻，较其余几组，板层小体空泡化明显减轻且包膜上微绒毛也明显减少，大多细胞核为椭圆形(图2)。

3 讨论

随着心脏外科技术的发展，体外循环心内直视技术在很多医院得到了开展，大量理论研究和临床实践已经表明，急性肺损伤已经成为体外循环手术后最常见的并发症之一，几乎所有患者体外循环术后均有一定程度的肺损伤，轻者仅表现为一过性的临床症状，重者表现为急性呼吸衰竭，危及生命。研究表明急性肺损伤主要与全身炎症反应、缺血再灌注损伤及体外循环过程中肺处于高氧耗高代谢状态有关。全身炎症反应主要是麻醉、手术创伤、体外循环等因素对机体造成的打击，尤其是体外循环开始时，血液等需与人工管道等非生理接触导致补体系统的激活［2］，补体激活产物刺激中性粒细胞在肺内聚集并进入肺间质和肺泡，从而导致肺水肿、肺顺应性降低，血氧含量下降［3］;其次是肺脏的缺血再灌注引起的损伤，体外循环过程中同时停止了机械通气，肺处于缺血缺氧状态，产生大量毒性氧代谢产物和氧自由基，导致膜脂质过氧化增强，产生多种醛类物质、如丙二醛等，改变了生物大分子的功能、破坏了核酸及染色体从而引起肺损伤。另外，肺的缺血再灌注导致肺血管内皮细胞损伤，减少了内皮源性舒血管物质一氧化氮(NO)的合成而引起肺损伤。Palatianos等［4］研究表明，小剂量的NO可以预防中性粒细胞在肺内积聚。

LS是一种新型的钙增敏剂，于2000年在瑞典上市，因其既能够提高心肌收缩力，又不增加心肌细胞内钙浓度和细胞耗氧而被被临床用于治疗各种急性心力衰竭病。有研究指出，LS具有减少炎症因子的产生、抗细胞凋亡、抗缺血再灌注等作用。Gecit等［5］对小鼠肾脏缺血再灌注损伤的研究中发现，经过LS腹腔注射的实验组与对照组对比，肾组织中保护性酶SOD含量明显升高，而MDA含量明显减少。Honich等［6］应用阻断/开放小鼠前降支的方法制作的小鼠心肌缺血再灌注的损伤模型中，再灌注前应用LS能明显减少心肌梗死面积。研究表明，左西孟旦明显减少心肌细胞的凋亡，而且其可以上调心肌细胞中抗凋亡基因bcL-2的表达，减少可溶性凋亡信号因子Fas/Fas配体的产生，从而抗发挥其抗心肌细胞凋亡的作用［7-8］。Dubin 等［9］研究表明，应用LS后，感染性休克肠道血流会增加，黏膜下酸中毒同样可以被减轻，这可能是因为LS能够改善肠道灌注。Scheiermann等［10］在感染性休克动物模型中应用了LS，研究发现炎症的释放被抑制，酸中毒被减轻，生存时间得到了延长;另外在大鼠的急性肺损伤模型中，与多巴酚丁胺(DOB)组及对照组相比，应用LS后，肺组织炎症反应明显可以被减轻，细胞凋亡也可以被抑制，LS的免疫调节以及抗凋亡的特性可能是其保护器官功能的又一重要机制［11］，在犬的CPB模型中，会有氧自由基过量增多，与肺组织中的细胞膜产生脂质过氧化反应而导致细胞膜通透性增加导致Ca2+超载、线粒体肿胀，影响细胞膜内的能量代谢，导致细胞损伤;脂质过氧化反应还会导致溶酶体膜损伤引起溶酶体外漏再次加重细胞损伤。OFR还可通过与蛋白质中的残基发生反应使蛋白质的一级结构被破坏，损伤蛋白质功能、降低或丧失蛋白酶的活性，从而改变肺的结构，引起肺组织损伤;这些都是OFR造成肺损伤的重要因素。氧自由基是肺组织的缺血再灌注所引起的肺损伤起着重要作用，贯穿整个损伤过程。其中膜结构脂质过氧化过程会形成一种毒性较大的过氧化产物MDA［12］，而SOD是一种重要的氧自由基清除剂他们接过仅比较稳定，容易测定，是目前公认的能较好反映机体内氧自由基水平及脂质过氧化程度的间接指标［13］。本研究显示，与C组相比，LSP组、P组及LSIV组MDA含量均明显降低，且SOD活性明显升高(P＜0.01)，与LSP组相比，LSIV组及P组MDA含量明显升高，且SOD活性明显降低(P＜0.01)，P组和LSIV组无统计学意义(P＞0.05)。结果示单纯肺动脉灌注、LS静脉注射及肺动脉灌注均具有肺保护作用，但其具体机制待进一步研究。

综上所述，虽然目前CPB术后肺损伤的机制尚未完全明确，但应是一个多因素的共同作用的结果，可能与CPB术后全身炎症反应、肺组织的缺血—再灌注损伤有关。本实验通过建立犬体外循环肺模型，并使用静脉注射、肺动脉灌注使用LS等不同的实验方法，得出结论LS肺动脉灌注可明显减轻术后MDA含量及增加SOD活性，具有急性肺损伤的保护作用。

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