乌头提取物对心衰大鼠抗氧化能力的研究

刘 颖，谭波宇

(湖南省人民医院药学部，湖南长沙 410005)

心力衰竭(HF)是一种由于心肌受损、心脏的持久过负压引发的疾病，严重时导致心脏失代偿，血液不能运达供给全身，以心功能不全为主要表现。本病归属于中医学“心悸”、“喘证”、“水肿”、“痰饮”等范畴［1］。超氧化物歧化酶(SOD)是人体内的一种抗氧化酶，它的主要作用在于其特异性能够清除超氧阴离子，同时催化超氧化自由基(ROS)分解，并在过氧化酶的作用下发生氧化反应［2］。丙二醛(MDA)是过氧化脂质的分解产物，它可引起蛋白质变性，酶及激素失活等。研究发现心衰时，机体内氧化能力降低，SOD、MDA与还原型谷胱甘肽(GSH)的水平则呈现一个较低的状态，进行抗心衰治疗后，机体抗氧化能力有所恢复，SOD、MDA 与 GSH 的水平也有所上升［3-5］。乌头作为祖国医学中的温补药物，在记载中对于心衰的治疗往往具有较好的疗效，笔者通过观察在乌头提取物作用下Wistar大鼠体内SOD、MDA、GSH指标，来探究乌头提取物对心力衰竭的治疗效果，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 动物实验 选取心衰Wistar大鼠90只，由中山医科大学动物中心提供(动物合格证号SCXK 2004-0011)，采用随机数字表分为实验组、对照组及空白组，每组30只，依据遵循中国科学技术委员会制定的《实验动物管理条例》进行实验操作。各组实验动物的体重、饲养方式差异无显著性。

1.2 主要试剂及仪器 乌头(湖南省人民医院药剂科);SOD分析试剂盒(南京建成生物工程研究所);MDA分析试剂盒(南京建成生物工程研究所);GSH试剂盒(南京建成生物工程研究所);立式压力蒸汽灭菌器(西安中诺尔仪器有限公司)、电子天平(赛多利斯分析天平)、低温高速离心机(湖南湘仪离心机有限公司)、旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器)、旋涡混匀器(合肥艾本森科学仪器有限公司)、流式细胞分析仪、分光光度计(上海圣科仪器设备有限公司)以及共聚焦显微镜(奥林巴斯中国有限公司)等。

1.3 制备乌头提取物 取干燥的乌头根300 g粉碎，过30目筛。以乙醇为溶剂，索氏提取器回流提取，过滤并用旋转蒸发仪回收溶剂得乙醇提取物浸膏。加入少量水使混悬，而后依次用石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇依次萃取，用旋转蒸发仪回收溶剂，最终制取3 g·mL-1药物浓度的乌头提取物。

1.4 制备模型 实验组与对照组采用腹主动脉缩窄法制作慢性心衰大鼠模型［6］。大鼠用1%戊巴比妥钠溶液0.35 mL/100 g腹腔注射麻醉后，绑于鼠台上，用碘酒擦拭待剪开的皮肤，在剑突下腹正中开2～3 cm口，分层打开腹腔，将脏器挤压在大鼠的右侧以便找寻腹主动脉，在肾动脉分支以上钝性游离腹主动脉，穿过4号手术线并系一活扣，将7号注射器针头平行置于腹主动脉上，用4号手术丝线将腹主动脉和注射器一同结扎，松紧适中，然后缓慢将注射器撤出，给青霉素1支(8万单位)，关腹，分层缝合。

1.5 治疗方法 造模成功后，实验组与对照组以地高辛20 mg·kg-1尾静脉注射，每日一次，连续干预28 d，空白组以等体积生理盐水尾静脉注射0.04 g·kg-1，共28 d。实验组给予上述乌头提取物溶液灌胃0.04 mg·kg-1，共28 d。成功建模后选取第0天，第7天和第28天，每组分别选取10只动物，采取腹腔注射麻醉后，腹主动脉并取血，检测SOD、MDA与GSH水平。

1.6 观察指标及检测方法

1.6.1 观察检测SOD、GSH活性 应用黄嘌呤氧化酶法:血液离心(3 500 r·min-1)处理10 min，留取上清液检测SOD、GSH活性。测定管及对照管分别加入试剂或样品，充分混匀后放置在37℃水浴箱中作用40 min，加入显色剂后混匀，静置10 min倒入光径比色杯中，在波长550 nm处用蒸馏水调零，比色测定各样本A值，依据按公式计算SOD活性。

1.6.2 检测MDA含量 检测MDA含量应用TBA比色法:离心(3 500 r·min-1)处理心肌组织10 min，取上清液待测。标准管、标准空白管以及测定管中分别加入乌头提取物，旋涡混匀器混匀后，用保鲜膜扎紧试管口，刺一小孔，放置在水浴箱中(95℃)作用40 min后取出，流水冷却，离心(3 500 r·min-1)处理10 min，取上清液置入光径比色杯，在波长532 nm处采取蒸馏水调零处理，比色测定A值，按公式计算MDA含量。

1.7 统计学方法 采用统计学软件SPSS19.0进行统计学分析，三组计量资料采用单因素方差分析的方法，三组之间两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 各组SOD活性比较 对照组与实验组的心衰大鼠体内SOD值明显低于空白组，实验组的变化小于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 治疗前后心衰大鼠体内SOD活性比较情况(±s)

表1 治疗前后心衰大鼠体内SOD活性比较情况(±s)

注:与空白组比较，#P ＜0.05，与实验组相比，*P ＜0.05。

组别氧化物歧化酶SOD/U·mL-1 0 d 7 d 28 d实验组 126.9 ±26.3# 168.4 ±16.5# 193.5 ±12.5#对照组 131.4 ±18.5# 864.3 ±25.4#* 839.1 ±28.6#*空白组215.2 ±13.3 213.8 ±11.6 202.7 ±10.4

2.2 各组MDA含量比较 对照组与实验组的心衰大鼠体内MDA值明显高于空白组，实验组的变化小于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 治疗前后心衰大鼠体内MDA含量比较情况(±s)

表2 治疗前后心衰大鼠体内MDA含量比较情况(±s)

注:治疗后，与空白组比较，#P＜0.05，与实验组相比，*P＜0.05。

组别丙二醛MDA/mmol·L-1 0 d 7 d 28 d实验组 3.69 ±0.75 14.43 ±8.32# 26.48 ±4.64#对照组 4.01 ±1.35 10.25 ±5.62#* 17.67 ±4.36#*空白组6.69 ±0.75 6.78 ±0.65 6.85 ±0.38

2.3 各组GSH含量比较 对照组与实验组的心衰大鼠体内MDA值明显高于空白组，实验组的变化小于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

表3 治疗前后心衰大鼠体内GSH含量比较情况(±s)

表3 治疗前后心衰大鼠体内GSH含量比较情况(±s)

注:治疗后，与空白组比较，#P＜0.05，与实验组相比，*P＜0.05。

组别还原性谷胱甘肽GSH/μmol·L-1 0 d 7 d 28 d实验组 16.43 ±6.54 26.23 ±5.64# 40.24 ±7.26#对照组 15.25 ±1.35 22.87 ±7.28#* 28.46 ±5.46#*空白组41.12 ±5.78 42.10 ±6.25 44.86 ±7.81

3 讨论

心力衰竭是世界范围内引发严重病症甚至死亡的疾病之一，各种心脏病发展到严重阶段都会引发心衰，心脏失代偿导致供血不足，是一种高发病率的临床病症状群。是指在致病性因素的作用下，心收缩功能与舒张功能所发生的障碍，心泵血功能发生降低，使得心输出量出现下降，以至于无法满足机体正常的代谢需要进而出现的一种病理过程。在疾病发生发展的早期，交感神经系统和肾素—血管紧张素—酸固酮系统被激活，心肌出现增生和肥厚，这在一定程度上是发挥了代偿性作用，但是这一类的代偿性机制却会导致心功能的进一步损伤，其最终结果是加速了疾病的发生发展。当心衰发生时，可以通过监测SOD、MDA与GSH这些指标来观察心肌抗氧化能力并由此来监测疾病发展［7-10］。SOD是细胞内所含有的一种抗氧化酶，它通过清除超氧阴离子，减弱氧自由基对细胞的损伤，从而起到保护机体的作用，SOD含量的多少能够间接的反映机体对氧自由基的清除能力。本实验通过测定SOD来观察乌头提取物是否能对抗自由基的损伤［11-13］。MDA是指在氧自由基的攻击下，生物膜中的不饱和脂肪酸发生了脂质过氧化性反应，其最终产物即为MDA，因为其较强的细胞毒作用可造成细胞的损伤和组织功能的损伤，又因其能够促进氧自由基的产生，细胞毒作用会得到进一步的扩大。含量的多少亦可间接反映体内细胞所承受的自由基损伤强度。本实验结果提示乌头提取物可能通过调节MDA含量来发挥心血管保护及抗心衰作用［14-16］。GSH则是一类通过催化过氧化物反应，减少氧自由基的生成，从而能够保持细胞完整的结构及功能。本实验结果亦可提示，乌头提取物组GSH水平升高，其可能的途径是通过抑制氧自由基途径从而来发挥对心肌的保护作用［17-18］。GSH是细胞内重要的抗氧化物质，因此若抗氧化能力增强，则由心衰引起的心功能不全等一系列病症将减轻。在以往的心衰治疗中主要以利尿剂，血管扩张剂等以软血管为主的药剂进行治疗，虽效果明显但副作用大，预后不好易复发。根据文献记载乌头碱是川乌、草乌等中药的主要有毒成分，可以刺激迷走神经，使心率失常，当心衰发生时，在乌头碱的毒性刺激下可以加强脂质过氧化反应，MDA含量增加，SOD活力降低，GSH升高，抗氧化能力加强［19］。

本次试验中，造模成功后大鼠血清SOD、GSH与MDA水平明显低于空白组，提示心衰大鼠体内抗氧化能力减低;干预28 d后，大鼠血清SOD、GSH与MDA水平上升，体内抗氧化能力有所提高，与对照组相比，实验组提高明显，差异具有统计学意义，由此可发现乌头提取物能够增强抗氧化能力从而使的抗心衰效果明显高于地高辛的应用效果。实验研究表明乌头提取物通过刺激心肌活性，可增强心率，进而增强心肌抗氧化能力。乌头作为中草药其药理作用包括驱风活血，散痉止痛、麻醉败毒、免疫调节、心血管作用和抗肿瘤作用［20-22］。从中医角度心衰是由于心肾阳虚，瘀血、水停等引起，古代医家应用乌头等中药进行治疗，如今随着医疗事业的发展中西结合治疗对疾病的防治更为有效，研究人员对乌头的有效成分进行提取，并利用乌头提取物对心衰患者进行更有效的治疗［23-24］。在心衰疾病过程中抗氧化能力的提升能够使心衰机体维生素E增加，血液抗氧化活性加强，降低脂过氧化引发速度，能有效的保护心肌细胞，从而明显改善心功能。由于本实验中仅对乌头提取物的作用做了初步研究，由于受到实验研究条件的限制，因此对于本次实验中所获得的关于大鼠的研究结果是否具有代表性，有无种属差异，其抗心衰效应与临床作用是否能得到统一，以使乌头提取物更好地服务于临床，仍有待下一步的研究。

综合本实验研究结果，我们相信乌头提取物能够有效的改善心肌抗氧化能力从而达到治疗心衰的目的，临床有较好疗效值得推广。

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