乌司他丁对百草枯诱导急性肺损伤的保护作用研究

吴 冰 郑彦宏 侯振才 菅向东 崔 勇

百草枯(Paraquat，PQ)，又名对草快、克无踪，属于二吡啶类除草剂，是目前使用最广泛的有机杂环类接触性脱叶剂及除草剂之一，我国作为农业大国，在农村地区也有广泛的使用。1966 年Bulhvant 首次报道了2 例百草枯中毒死亡病例［1］，此后世界各地相继报道百草枯中毒病例。百草枯急性中毒后以肺为主要靶器官，导致严重低氧血症的进行性肺纤维化，患者常死于急性呼吸窘迫综合征。目前针对百草枯中毒并无特效药物，常规对症治疗效果极差，故百草枯中毒患者总病死率为20%～75%，口服病死率更高，达60%～80%，且存活者大多存在严重的肺间质纤维化，预后极差［2］。乌司他丁(Ulinastin，UTI)作为一种广谱的蛋白水解酶抑制剂最早应用于急性胰腺炎的治疗，近年来乌司他丁临床广泛应用于危重症的抢救与治疗［3］，但其应用在PQ 急性中毒的报道较少。本试验通过建立急性口服PQ 中毒大鼠模型并通过UTI 进行干预，试图寻找一种临床治疗急性PQ 中毒新的方法。

1.材料与方法

1.1 试验动物及主要试剂 清洁级Wistar 大鼠45 只，购于山东大学试验动物中心，雌雄不限，体重在240～260g，标准饲料。20%PQ 溶液购于英国先正达有限公司农药部，UTI 购于广东天普医药有限公司，GSH-px 检测试剂盒、MDA检测试剂盒、SOD 检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.2 试验分组与模型建立 45 只健康Wister 大鼠，适应性饲养1 周，利用随机排列表将其分成三组:空白对照组(NS 组，N=5 只)灌胃给予等容量生理盐水;PQ 组(N=20)和UTI 组(N=20)将PQ 按30mg/kg 用生理盐水稀释后一次灌胃注入染毒;UTI 组染毒后30 分钟按100000u/kg 乌司他丁腹腔注射。每组取8 小时、24 小时、48 小时、72 小时共4 个时间观察点，每个时间点随机选取5 只腹腔注射苯巴比妥钠(100mg/kg)麻醉后腹主动脉放血处死。

1.3 血浆及支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolarlavage fluid，BALF)中SOD、MDA、GSH-Px 的测定 分别检测8 小时、24 小时、48 小时、72 小时共4 个时间观察点测定血浆与BALF 中的SOD、GSH-px 活性与MDA 水平。SOD 用黄嘌呤氧化酶法;MDA 测定用硫代巴比妥酸比色法;GSH-Px 可以促进过氧化氢(H2O2)与GSH 反应生成H2O 及氧化型谷胱甘肽(GSSG)，GSH-Px 的活力可用其酶促反应的速度来表示。

2.结果

2.1 血浆和BALF 中MDA 含量的变化 在对应时间点PQ 组血浆与BALF 中MDA 含量较NS 组明显升高，差异有显著性(P ＜0.01);UTI 组血浆中MDA 水平较NS 组升高(P ＜0.01)，BALF 中MDA 含量与NS 组比较无显著性差异。UTI组血浆与BALF 中MDA 含量升高程度较PQ 组低，差异有显著性(P ＜0.05 或P ＜0.01)。

表1 血浆和BALF 中MDA 含量的变化(，nmol/ml)

表1 血浆和BALF 中MDA 含量的变化(，nmol/ml)

注:* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs.空 白 对 照 组;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs.PQ 组。

2.2 血浆与BALF 中SOD 活性的变化 在对应时间点PQ 组较NS 组血浆中SOD 活性逐渐降低，于24 小时、48 小时、72 小时明显降低(P ＜0.01);BALF 中SOD 活性于8 小时、24 小时明显降低(P ＜0.01)，48 小时、72 小时明显升高(P ＜0.01)。UTI 组血浆中SOD 活性与NS 组比较无显著性差异，而BALF 中SOD 活性较NS 组于24 小时、48 小时、72 小时时明显升高(P ＜0.01)。UTI 组与PQ 组比较，血浆与BALF 中SOD 活性升高显著(P ＜0.05 或P ＜0.01)。见表2。

表2 血浆与BALF 中SOD 活性的变化(，U/0.1ml)

表2 血浆与BALF 中SOD 活性的变化(，U/0.1ml)

注:* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs.NS 组;# P ＜0.05，##P ＜0.01 vs.PQ 组。

2.3 血浆与BALF 中GSH-Px 活性的变化 在对应时间点PQ 组和UTI 组在血浆与BALF 中GSH-Px 活性呈逐渐降低趋势，48 小时、72 小时明显低于NS 组(P ＜0.01)。但是UTI组与PQ 组比较，GSH-Px 活性下降程度明显要小(P ＜0.01)。见表3。

表3 血浆与BALF 中GSH-Px 活性的变化(，U/ml)

表3 血浆与BALF 中GSH-Px 活性的变化(，U/ml)

注:* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs.NS 组;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs.PQ 组。

3.讨论

百草枯是广泛应用的除草剂，可导致人类和试验动物严重的致命的肺纤维化，被称作“百草枯肺”。肺是PQ 作用的主要靶器官是由于肺内存在双胺和聚胺类物质的主动转运机制，PQ 与胺类物质竞争通过肺泡Ⅱ型细胞的能量依赖性多胺摄取途径，被肺泡Ⅱ型细胞主动转运而摄取［4］，中毒后肺组织的PQ 浓度是血浆浓度的10～90 倍。PQ 被肺泡细胞摄取后经过氧化还原反应产生大量的氧自由基［5，6］，使机体出现氧化应激，诱导脂质过氧化反应，除直接损害非肺泡细胞膜主要成分-磷脂(富含多不饱和脂肪酸)外［7］，还可引起细胞线粒体内钙稳态失衡［8］、膜透性增加从而引起细胞和线粒体肿胀导致肺损伤。MDA 是过剩的自由基攻击细胞膜中多聚不饱和脂肪酸脂质过氧化的降解产物，间接反映氧自由基对细胞的损伤程度及抗脂质过氧化损伤的能力;SOD 与GSH-Px 是构成肺内抗脂质过氧化酶性保护系统的主要酶，其活性间接反映机体清除自由基的能力，故MDA、SOD 和GSH-Px 常被用作自由基损伤的观察指标［9］。

通过本试验我们发现PQ 染毒后血浆中GSH-Px、SOD 活力显著下降，MDA 含量则显著升高;BALF 中GSH-Px、SOD 活力均下降，MDA 含量升高。这些改变可能与PQ 在体内代谢过程中生成活性氧自由基的过程有关:PQ 进入体内先产生O2-，再在SOD 下形成H2O2［5］，故中毒早期血浆中SOD 活力降低明显。PQ 中毒时晚期见BALF 中SOD 活力稍升高，而GSH-Px 活力显著下降，这可能与PQ 中毒后期在肺脏产生的H2O2 较多有关。因为H2O2半衰期长，容易透过细胞膜，可迅速形成较O2-更强的氧化剂OH-，在这个过程中要消耗大量的GSH-Px［10］。

UTI 是从健康男性新鲜尿液中分离纯化的一种酸性糖蛋白，其分子由两个Kunitz 型区域组成其基本骨架，属自然界广泛存在的Kunitz 型蛋白酶抑制剂，具有很广的抑酶谱。降解后形成的低分子产物对酶抑制作用更强。乌司他丁分子中还具有与细胞膜受体识别和结合的位点，加上第10 尾丝氨酸上带负电荷的硫酸软骨素糖链，使其表现出稳定细胞膜和溶酶体膜的生理作用。此外，UTI 对于兔油酸诱导的肺损伤保护［11］和对于先心病患者体外循环的干预作用等研究［12］均提示UTI 能有效减少氧自由基的产生和释放，抑制脂质过氧化反应。本研究也发现给予UTI 后与PQ 组相比较，血浆及BALF 中MDA 含量下降，SOD，GSH-Px 升高，且血中SOD 和BALF 中GSH-Px 升高显著。

综上所述，本试验证实氧化应激与脂质过氧化在PQ 中毒引起的急性肺损伤机制中发挥重要作用。UTI 可对抗急性PQ 中毒大鼠的氧化性损害，并增强机体抗氧化的能力，抑制脂质过氧化作用，显示出对于急性PQ 中毒大鼠肺损伤的保护作用，为临床急性PQ 中毒患者的治疗提供了新的思路和方法。

1 Bulivant CM.Accidental poisoning by paraquat:Report of two cases inman［J］.British Medical journal，1966，5498:1272-1273.

2 杜艳丽，杜勇.百草枯中毒临床分析［J］.医学论坛杂志，2007，28(5):14-15.

3 吴腓，余小云，雷涌，等.乌司他丁对危重症患者器官功能保护作用的研究［J］.中国中西医结合急救杂志，2008，15(5):269-271.

4 Tampo Y1.Superoxide production from paraquat evoked by exogenous NADPH in Pulmonary endothelial cells［J］.Free Radic Biol Med，1999，27(5-6):588-595.

5 Wilhelin J，Frydrychova M，ViZek M.Hydrogen peroxide in the breath of rats:the effect of hypoxia and Paraquat［J］.Physiol Res，1999，48(6):445-491.

6 Jones GM，Vale JA.Mechanisms of toxicity，clinical features，and management of diquatpoisoning:a review［J］.J Toxicol ClinToxicol，2000，38(2):123-181.

7 Orito K，Suzuki Y，Matsuda H，et a1.Chymase is activated in the pulmonary inflamemation and fibrosis induced by paraquat in hamsters［J］.Tohoku J Exp Med，2004，203(4):287-294.

8 曹钰，董玉龙，胡海，等.钙稳态失衡在百草枯中毒肺损伤中的作用［J］.四川医学，2005，7(26):741-743.

9 赵世民主编.医学自由基的基础与临床［M］.山东:山东大学出版社，1993:30-72.

10 Mustafa A，Gado AM，AI-Shabanah OA，et a1.Protective effect of aminoguanidine against paraquat-induced oxidative stress in the lung of mice［J］.Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol，2002，132(3):391-397.

11 谭朝华、徐军美，杨东林，等.乌司他丁对兔急性肺损伤保护的试验研究［J］.中国医学工程，2005，13(2):181-184.

12 Hawkins DL，Mackay RJ，Mackay DL，et al.Human TGF-beta and interleukin-10 suppresses production of inflammatory mediators by LPSstimulated equine peritoneal macrophages［J］.Vet Immunol Immunopathol，1998，66(1):1-10.