基于HRM 的小扩增子法研究ABCA1 基因变异与良性前列腺增生及前列腺癌的关联

张 政 孙 亮 李星慧 魏 东 王晓明 杨 泽 王建业 张毓洪

ATP 结合盒转运蛋白A1(ABCA1，ATP-binding cassette transporter A1)与疾病的潜在关联近年来被广为关注，已发现其与上皮卵巢癌［1］、心血管疾病及胆固醇代谢病相关［2］。ABCA1 可参与磷脂类和胆固醇的跨膜逆转运［3］，与PCA 的进展密切相关，是前列腺上皮细胞中胆固醇转运的最主要通路分子［4］。由于胆固醇与雄激素合成关系密切，而雄激素的紊乱与男性良性前列腺增生(BPH)和前列腺癌(PCA)关系密切。BPH 及PCA 已经成为近年来影响我国老年男性的重要疾病［5］，但是关于ABCA1 基因变异与BPH 和PCA 的相关性还缺乏研究。

HRM 技术具有高通量、高敏感度且经济的优势，目前已被广泛应用于多种疾病的遗传分析，本研究通过建立基于HRM 的小扩增子(small-amplicon)技术，并初步进行临床分型应用，探索ABCA1 基因变异rs2230806，rs2066882 与BPH 及PCA 的关联。

1.材料与方法

1.1 研究对象 在北京医院2011～2014 年建立的遗传资源库中，按照十二五科技支撑计划中的纳入和排除标准，最终共纳入BPH 患者391 例，PCA 患者222 例，真阴性对照组86 例(正常PSA/IPSS 评分)。所有研究对象均为汉族北方人群，均签署知情同意书，研究流程经北京医院伦理委员会批准。采集外周静脉血，EDTA3K 抗凝，-20℃保存。

1.2 试剂与仪器 全基因组DNA 提取试剂盒，PCRmix 购自北京康为世纪公司，饱和荧光染料购自美国Idaho 公司。主要仪器包括:美国Idaho 公司Lightscanner TMHR-I 96 高分辨熔解曲线(high resolution melting，HRM)检测系统;Nanodrop ND-2000 进行DNA 定量;美国BIO-RAD 公司PTC-225 型PCR 扩增仪。

1.3 试验方法

1.3.1 基因组DNA 的提取:每个样本取300μl 全血，按试剂盒说明书进行基因组DNA 提取，工作液浓度稀释至20ng/μl，储于4℃。

1.3.2 小扩增子(small-amplicon)扩增:从NCBI 数据库中查取ABCA1 基因rs2066882 和rs2230806 附近的基因序列，用Oligo7.0 软件设计相应引物(表1)。试验采用10μl 的PCR 反应体系，包括PCRmix5ul，水2.8μl，DNA 模板1μl，饱和荧光染料0.8μl，高低温内参、上下游引物各0.1μl。PCR 程序:95℃预变性5 分钟后进入主循环，95℃变性30 秒，退火30秒，72℃延伸10 秒，共35 个循环，72℃延伸3 分钟。

1.3.3 HRM 检测:PCR 反应体系中加入饱和荧光染料(LC-Green-plus)会在DNA 扩增的每一个循环中嵌入到碱基之间，随着逐渐升DNA 解链，释放碱基之间的荧光信号，根据双键与三键之间荧光信号强度不同进行基因分析。Lightscanner TMHR-I 96 所采集的熔解曲线的温度范围为45℃～95℃，用LightScanner Call IT 软件的small-amplicon 系统分析采集到的曲线，判定具有相同基因型的个体。从每个SNP 位点的3 个不同基因型中，随机抽取30%的样本，进行Sanger法测序验证。

1.4 统计学方法 样本的群体代表性均经Hardy-Weinberg 平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)进行检验。使用SPSS 16.0 软件完成统计分析。相关基因型或等位基因频率的比较用Fisher 确切概率法或Pearson 卡方检验(检验水准α设为0.05)。

2.结果

2.1 rs2066882 和rs2230806 的基因分型结果 利用HRM 小扩增子法成功对rs2066882 和rs2230806 进行分型，熔解曲线见图1，其中最先解链的为杂合子，其次为AA/TT 纯合子，最后解链的为GG/CC 纯合子。各基因型抽取30%经Sanger 测序验证完全一致。

2.2 BPH 风险基因关联分析 rs2230806 的AA/AG/GG基因型分布在PCA、BPH 和正常对照组间没有统计学差异(χ2=1.323，P=0.858，df=4);rs2066882 的AA/AG/GG 基因型分布在PCA、BPH 和正常对照组间差异具有统计学意义(χ2=46.234，P ＜0.001，df=4)。ABCA1 基 因 rs2066882 和rs2230806 在PCA 组、BPH 组和正常对照组间的分布情况见表2，结果显示，rs2066882 的不同基因型在PCA 组和对照组(P ＜0.001，OR=3.708，95%CI=2.088～6.586)，BPH 组和对照组(P ＜0.001，OR=3.871，95%CI=2.308～6.492)间均存在统计学差异。

表2 ABCA1 基因2 个变异的基因型在PCA、BPH 及正常对照组中的分布

3.小结

大数据时代对遗传诊断技术提出了新的要求，传统的限制性内切酶消化及测序技术存在通量低、成本高、操作复杂等限制［6］，难以进行推广实施。本文建立的基于高分辨熔解曲线(HRM)技术的变异位点小扩增子分型技术是一种检测通量高、敏感度高、操作简单，且经济的SNP 分型技术［7］，极具临床转化和应用价值。对于前列腺癌和良性前列腺增生的易感人群，需早期进行基因分型，并掌控其最佳干预时机，通过早期控制生活方式和环境因素等达到降低疾病发生风险的目的。本研究通过HRM-Idaho LightScanner 分析，对391 例BPH患者，222 例PCA 患者和86 例正常对照者的DNA 样本进行分型应用。

本文所建立的基于小扩增子法的HRM 分型技术成功对ABCA1 基因变异rs2230806，rs2066882 两个SNP 位点进行基因分型，不受限于基因变异的位置特征，可成功区分两个变异位点的不同突变型和野生型，并且达到较高的重复性和准确性，经Sanger 法测序验证结果完全一致。与传统的基因分型方法相比，HRM-Idaho LightScanner 分析方法具有高通量、高敏感且操作方便等特性，并能够在前列腺癌和良性前列腺增生患者中达到较高的准确性和重复性。对研究的两个SNP分型结果分析发现，风险等位基因rs2066882-A 的携带可增加BPH 和PCA 的风险。

1 Hedditch E L，Gao B，Russell A J，et al.ABCA Transporter Gene Expression and Poor Outcome in Epithelial Ovarian Cancer［J］.J Natl Cancer Inst，2014，106(7):dju149.

2 Van Eck M.ATP-binding cassette transporter A1:key player in cardiovascular and metabolic disease at local and systemic level［J］.Curr Opin Lipidol，2014.

3 Xu Y，Liu Q，Xu Y，et al.Rutaecarpine suppresses atherosclerosis in ApoE-/-mice through up-regulating ABCA1 and SR-BI within RCT［J］.J Lipid Res，2014，jun 7.

4 Lee B.H，Taylor M G，Robinet P，et al.Dysregulation of cholesterol homeostasis in human prostate cancer through loss of ABCA1［J］.Cancer Res，2013，73(3):1211-1218.

5 Ban，J.Y，K.H.Yoo.Promoter Polymorphism (rs12770170，-184C/T)of Microseminoprotein，Beta as a Risk Factor for Benign Prostatic Hyperplasia in Korean Population［J］.Int Neurourol J，2014，18(2):63-67.

6 孙亮，王晓霞，史晓红，等.应用基于HRM 的LunaProbe 技术检测2 型糖尿病易感基因FTO 的三个变异位点［J］.中国卫生检验杂志，2013，23(03):529-531.

7 Ganopoulos P，Pozo P，Zambounis A，et al.High-resolution melting analysis allowed fast and accurate closed-tube genotyping of Fusarium oxysporum formae specials complex［J］.FEMS Microbiol Lett，2012，334(1):16-21.