广西壮族人群帕金森病LRRK2 基因的多态性分析

庞国防 梁庆华 吕泽平※ 胡才友 黄东挺 周博峰 黄春丽 余天智唐凤川 秦娇琴 杨 泽

帕金森病(Parkinson's Disease，PD)的病因及发病机制仍未明了，但普遍认为是环境和遗传因素交互作用的结果［1］，5%～10%的PD 患者表现为常染色体显性或隐性遗传，因此，对遗传易感基因的筛查成为近期研究PD 的热点之一。富亮氨酸重复激酶(Leucine-rich repeat kinase2，LRRK2)基因的一些单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism，SNP)分别在常染色体隐性早发(50 岁前发病)及常染色体显性晚发(50 岁后发病)PD 的发病中可能扮演重要的角色，而且呈现明显的群体及地域特异性［2～4］。

LRRK2 基因位于染色体12q，全长145kb，包括51 个外显子，编码含2575 个氨基酸的dardarin 蛋白(震颤蛋白)，其功能涉及到底物的结合、底物的磷酸化、蛋白-蛋白之间的交互作用等。LRRK2 的错义突变可导致不同程度的病理过程，例如R1441C，G2019S 和I2020T 突变明显减少Akt1 的磷酸化，引起神经细胞的退行性改变，因此LRRK2 被认为是家族性及散发性PD 的重要分子［6］。

本研究结合东亚人群常见的PD 相关基因变异，对壮族散发性PD 患者LRRK2 基因3 个SNP 进行基因分型，包括LRRK2 的 rs34778348 (G2385R)，rs1491942 (N511K)，rs7133914(R1398H)，了解这些多态与广西壮族PD 发病的相关性。

1.材料与方法

1.1 材料 ①PD 组:为2011 年5 月～2013 年12 月我院收治的散发PD 患者，无明显家族史，共112 例，年龄64.29±12.93 岁，其中男性59 例，女性53 例，均为壮族，患者主要来自南宁及周边的百色、河池等地区，并以50 岁为界分为早发及晚发亚组。诊断符合中华医学会神经病学分会运动障碍及帕金森病学组制定的标准［1，2］，由两位资深神经内科医生共同确定诊断。②对照组:为来自相同地区，年龄、民族、性别构成匹配的健康中老年人，共156 例，年龄62.85 ±11.62 岁，其中男性84 例，女性72 例。研究对象除了详细的神经系统检查外，常规的体格检查及身高、体重、血压等基本临床数据亦一并采集。研究对象知情并同意。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集:所有研究对象禁食12 小时后于清晨空腹采肘静脉血8ml，其中3ml ACD 抗凝血用于白细胞基因组DNA 提取，5ml 非抗凝血分离血清后用于血脂测定。

1.2.2 DNA 提取:采用经典的酚-氯仿法。

1.2.3 SNP 基因分型:采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态(PCR-RFLP)进行分型，引物参考文献［7～10］进行设计，由上海生工公司合成。各SNP 的基本特征、引物的序列、PCR 退火温度、内切酶种类、酶切产物大小等数据详见表1。PCR 反应总体积为20μL，其中2× Taq Master Mix(北京康为世纪生物科技有限公司)10μL，上、下游引物(0.2μmol/μl)各1μL，Taq DNA 聚合酶［宝生物工程(大连)有限公司］1U，基因组DNA200ng(1μL)及ddH2O 7μL。SNP rs1801582 的PCR条件:94℃预变性5 分钟后，94℃变性40 秒，59℃退火40 秒，72℃延伸50 秒，35 个循环，再72℃延伸10 分钟。取10μl PCR 产物加入0.2U 限制性内切酶Bsp1286I［宝生物工程(大连)有限公司］，72℃水浴消化4 小时，然后取酶切产物8μl 在2%琼脂糖凝胶中80V 电泳30 分钟。3 个SNP 的PCR-RFLP体系、条件及带型特点见表1。

表1 各SNP 的基本特征及基因分型策略

1.3 统计学方法:统计学分析采用SPSS 13.0 软件。本研究中统计指标均进行正态性检验，以表示。基因频率用直接计数法计算。Hardy-Weiberg 平衡采用拟合优度χ2检验。两组计量资料的组间比较采用t 检验，两组以上比较采用方差分析。分类资料组间比较采用卡方检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 研究对象的基本特征 两组人群的基本临床特征列于表2。如表所示，PD 组的饮酒比例、BMI、收缩压均明显大于对照组(均P ＜0.05)，而吸烟的比例小于对照组(P ＜0.05)，两组性别构成及年龄构成无明显差异(P ＞0.05)。

2.2 各位点的基因型频率及等位基因频率分布 PD 组和对照组在3 个多态位点上的基因型及等位基因频率分布情况及其与PD 的关联分析结果详见表3。3 个SNP 的分布均符合H-W 平衡。在LRRK2 基因的rs34778348 位点，A 等位基因携带者罹患PD 的风险也明显升高(OR=1.632，95%CI:1.238～2.346)但P 值稍弱(0.029)，总体上PD 组等位基因A 及纯合突变型AA 的频率明显高于对照组(P ＜0.05)。另2 个SNP 的基因型和等位基因频率分布在两组间无差异(P=0.445～0.894)。

表2 研究对象的基本临床特征

表3 广西壮族人群散发性帕金森病的相关基因及致病基因研究［n(%)］

3.讨论

本研究的主要结果是，在壮族PD 患者中，LRRK2 rs34778348(G2385R)的频率明显高于对照组(23.2% vs 7.4%，P ＜0.01;8.5% vs 4.2%，P ＜0.05)，携带rs34778348 A 等位基因的个体患PD 的风险是普通人群的1.632 倍，但基因型及等位基因频率在早发和晚发PD 之间无差异。因此，该位点可能是壮族散发性PD 的易感因素之一。而在LRRK2 rs1491942 位点，PD 组的C 等位基因频率明显高于对照组(43.4% vs 32.8%，P=0.006)。可见，PD 与LRRK2 基因的关联存在明显的群体特异性。

本组病例LRRK2 rs34778348(G2385R)等位基因A 的频率为8.5%，对照组为4.2%，A 携带者罹患PD 的风险明显高于普通人群，与中国西南汉族及东亚主要群体的结果类似［7，16］。此位点位于LRRK2 基因第48 外显子的WD40 结构域，使第7153 号核苷酸G 变成A，相应密码子GGG 变成GGA，编码同样的氨基酸Gly，被认为是一种沉默的、中性的点突变，在多个西方群体中没发现PD 患者与普通对照间的频率差异［2］。本组人群及其他东亚群体PD 患者高频等位基因A 的潜在生物学意义尚不清楚，与其他未知的致病突变存在连锁不平衡可能是其解释之一。

本研究所测基因位点有限，需要对基因其他位点和其他基因的变异筛查以及不同基因型PD 患者表型的长期随访进行进一步研究。

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