KLK3 基因变异与前列腺癌临床表型的关联研究

贾春媛 张毓洪 徐 勇 杨 阔 魏 东 张耀光 王建业※ 杨 泽

前列腺癌(PCa)是美国男性常见的恶性肿瘤，仅2010 年就有200，000 新发病例和30，000 死亡病例［1］。在我国男性泌尿生殖系统恶性肿瘤发病率中，PCa 已排在恶性肿瘤的第三位，它的发病率可用来评价50 岁以上我国男性期望寿命的风险性指标［2］。截止目前为止，普遍认为前列腺癌的发生是由环境和遗传因素，两者共同作用的结果［1，3，4］。Takata R 等人［5］进行了一项有关日本男性前列腺癌患者GWAS 和复制的研究，他们的研究提示了相同的结果。此外，他们还报道了五个新的前列腺癌易感基因位点5P15［P(GC)=3.9×10-18］，GPRC6A/RFX6［P (GC)=1.6× 10-12］，13q22［P(GC)=2.8×10-9］，C2orf43［P(GC)=7.5×10-8］and FOXP4［P(GC)=7.6×10-8］。这些发现有助于我们对前列腺癌的遗传基础有更深的理解，也表明前列腺癌的易感性在不同种族人群的遗传异质性。

为了确定这些变异是否与中国北方人群的前列腺癌患病风险有关，我们选取北京市和天津市PCa 患者与正常对照者，采用病例-对照方法对6 个基因位点进行关联分析，了解它们在PCa 患者的基因型与临床特征之间的关系。

1.材料与方法

1.1 材料 自2000 年1 月～2010 年12 月，收集北京医院泌尿外科和天津医科大学第二附属医院泌尿外科研究所确诊的266 例前列腺癌患者和288 例年龄匹配的健康对照者外周血标本，同时还有他们的临床资料，包括患者确诊时的年龄，血清PSA，Gleason 分级和临床分期。前列腺癌患者PSA超过20ng/ml，Gleason 评分≥8，和(或)病理分期≥Ⅲ期的被定义为侵入性前列腺癌。288 例对照者来自北京医院和天津医科大学第二附属医院的体检人群。PSA ＜4.0ng/ml，均无PCa 家族史。所有研究对象对此研究均知情同意。受试者均是来自我国北方地区的无亲缘关系的汉族人群。

1.2 SNP 的基因型位点选择与试验方法 根据欧美人群以前的GWAS 前列腺癌的风险研究，随机选取6 个SNPs。这些位点包括rs13385191，rs12653946，rs1983891，rs339331，rs9600079 和rs2735839。全血基因组DNA 提取试剂盒由北京Bio Chain 公司提供。采用PTC-225 扩增仪进行PCR 高分辨率扩增熔解曲线，包括初始变性95℃3 分钟，随后45 个循环95℃30 秒，退火30 秒，72℃延伸4 秒，经过94℃30 秒而后降至24℃2 分钟，进行2 个循环后结束。PCR 产物通过Light Scanner TMHR-I 96 进行HRM 分析。随机选取6 个样本基因进行PCR 扩增和测序，以确认基因分型结果。PCR 的检测方法为，预变性95℃3 分钟，随后在95℃30 秒进行35 个循环，退火30 秒，72℃延伸30 秒，72℃2 分钟完成。

1.3 统计学方法 统计采用SPSS16.0 版本处理数据。用比值比(OR)值和95%可信区间(95%CI)来评价相对风险。组间基因型频率及等位基因频率比较采用χ2检验或者Fisher 确切概率法。组间比较的差异设定P ＜0.05 为有统计学意义。用Hardy-Weinberg 平衡对样本群体基因型频率的代表性进行检验。

2.结果

2.1 临床数据 此次研究，前列腺癌患者的平均年龄72.17 ±7.72 岁，平均PSA 值46.42 ±143.11ng/ml。对照组平均年龄70.47 ±7.60 岁，平均PSA 值1.20 ±1.01ng/ml。两组间比较无显著性差异(P=0.129)。在表1 中，列出了266例前列腺癌患者的Gleason 评分、肿瘤分期、危险度分级等临床特征。

表1 前列腺癌患者的临床基本特征

2.2 6 个SNP 位点基因型与PCa 的关联分析

2.2.1 前列腺癌与SNP 位点的关联分析:Hardy-Weinberg 平衡检验对照组的基因型频率，其分布具有群体代表性(P ＞0.05)。由遗传学统计分析的6 个位点，经前列腺癌与对照组比较表明，只有一种等位基因频率，RFX6 基因(rs339331，C)与前列腺癌有显著性关联(OR=0.73，95%CI=0.57～0.94，P=0.013)。

2.2.2 前列腺癌相关的基因型:我们发现受试者与携带(CC+CT)基因型患者相比，这些携带TT 基因型中的RFX6基因(rs339331，C)更能降低前列腺癌的风险(OR=0.64，95%CI=0.45～0.90，P=0.008)(见表2)。

表2 6 个SNP 位点基因型与前列腺癌等位基因的频率分布［n(%)］

续表2

2.2.3 前列腺癌相关的危险因素分析:我们通过前列腺癌病例对照研究，比较了6 个SNP 与相关的临床表型，包括PSA 水平、年龄诊断、Gleason 评分、肿瘤分期和亢进型前列腺癌患者的分层分析。结果表明:仅有13q22(rs9600079，T)基因型与肿瘤分期可能存在关联(P=0.044，OR=2.34，95%CI=0.94～5.87)。对于其他SNPs，我们没有观察到前列腺癌病例与相关的临床表型有任何显著性差异(P ＞0.05)，见表3。

表3 rs9600079 位点基因型与前列腺癌患者临床指征的关联分析

3.讨论

激肽释放酶相关肽3(KLK3)基因的产物是用来检测人的前列腺特异性抗原(PSA)，它是前列腺癌(PCa)临床诊断的重要生物学标志物。G 蛋白偶联受体RFX6，C2orf43 和FOXP4 信号在前列腺癌发展中起到重要作用。我们研究了其中的6 个位点，涉及位于KLK3 的rs2735839(G)，C2orf43的rs13385191(G)，FOXP4 的rs1983891(T)，RFX6 基因的rs339331(C)，5P15 的rs12653946(C)，13q22 的rs9600079(T)。通过研究这些中国北方前列腺癌患者基因变异的情况，来判断他们与中国北方男性前列腺癌的发生是否有关。

KLK3 在19 号染色体属于15 激肽释放酶家族，其蛋白质产物是一种目前存在于精浆中的蛋白酶，在临床上称为PSA，这种蛋白的血清水平在诊断和监测前列腺癌中发挥作用。Waters［6］公司生产的多种族序列发现关联合并族群分析，KLK2/3(rs2735839)变异与前列腺癌风险可能关联(OR=1.06;95%CI=0.97～1.16;P ＜0.05)。但我们的研究没有发现KLK3 基因群与前列腺癌存在显著相关的统计学风险。

叉头蛋白4(ForkheadP4，FOXP4)的功能是转录抑制因子来抑制肺的外周血特异性基因的表达，是转录内分泌胰腺发育过程中直接分化胰岛细胞所需的因子。它分化胰岛细胞类型并且生产胰岛素，同时不需要胰腺PP(多肽生产)细胞分化。调控因子RFX6 迁移到NEUROG3 的下游，调节转录参与β 细胞的成熟，从而限制了β 细胞中的分化。通过形成转录激活与RFX3 和有约束力的X-box 中的异源二聚体靶基因的启动子。

在亚洲人口中与前列腺癌风险相关的四个SNPs，在欧洲人中也与前列腺癌风险有关。Batra 等［7］对1，357 例前列腺癌患者和欧洲的1，403 例健康的澳大利亚男性进行了相同的研究。在日本人群中发现5P15 (rs12653946)与前列腺癌发病风险显著相关(OR=1.20，95% CI:1.07～1.34;P=0.002)。高田等人［8］发现其5 个位点对前列腺癌具有易感性，在5P15［P(GC)=3.9×10-18］，GPRC6A/RFX6［P(GC)=1.6×10-12］，13q22［P(GC)=2.8×10-9］，C2orf43［P(GC)=7.5×10-8］和FOXP4［P(GC)=7.6×10-8］。后来Wang M等人［9］发现，3/4 的遗传变异与前列腺癌的风险有关联性(日本男性rs12653946 在5P15，P=4.33×10-8，rs339331 在6q22为4.43×10-5，rs9600079 在13q22 为8.42×10-4)。这些结果进一步提供了证据，即在日本男性中确定的PCa 风险基因也有可能有助于中国男性前列腺癌易感性基因的研究。

总之，我们的研究结果表明，RFX6 基因(rs339331，C)变体与前列腺癌风险有关，13q22(rs9600079，T)的变异关系到我国北方男性前列腺癌肿瘤分期。然而，在本项研究中的其他位点均没有得到同样的复制，可能表明其与中国北方的男性前列腺癌相关的风险等位基因无关。

1 Amundadottir L T，Sulem P，Gudmundsson J，et al.A common variant associated with prostate cancer in European and African populations［J］.Nat Genet，2006，38(6):652-658.

2 孙颖浩.我国前列腺癌的研究现状［J］.中华泌尿外科杂志，2004，25(2):77-80.

3 Lichtenstein P，Holm N V，Verkasalo P K，et al.Environmental and heritable factors in the causation of cancer—analyses of cohorts of twins from Sweden，Denmark，and Finland［J］.N Engl J Med，2000，343(2):78-85.

4 Schaid D J.The complex genetic epidemiology of prostate cancer［J］.Hum Mol Genet，2004，13(1):R103-R121.

5 Takata R，Akamatsu S，Kubo M，et al.Genome-wide association study identifies five new susceptibility loci for prostate cancer in the Japanese population［J］.Nat Genet，2010，42(9):751-754.

6 Waters K M，Le Marchand L，Kolonel L N，et al.Generalizability of associations from prostate cancer genome-wide association studies in multiple populations［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2009，18(4):1285-1289.

7 Batra J，Lose F，Chambers S，et al.A replication study examining novel common single nucleotide polymorphisms identified through a prostate cancer genome-wide association study in a Japanese population［J］.Am J Epidemiol，2011，174(12):1391-1395.

8 Gudmundsson J，Sulem P，Gudbjartsson D F，et al.Genome-wide association and replication studies identify four variants associated with prostate cancer susceptibility［J］.Nat Genet，2009，41 (10):1122-1126.

9 Wang M，Liu F，Hsing A W，et al.Replication and cumulative effects of GWAS-identified genetic variations for prostate cancer in Asians:a case-control study in the ChinaPCa consortium［J］.Carcinogenesis，2012，33(2):356-360.