SPE-GC-GC-TOFMS检测油脂中游离甾醇及精 炼废弃油脂的判别

徐宝成，张良晓，王 华*，杨青青，罗登林，李培武,6,7,8,*

（1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100；2.中国农业科学院油料作物研究所，湖北 武汉 430062；3.河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471003；4.农业部油料及制品质量监督检验测试中心，湖北 武汉 430062；5.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西葡萄与葡萄酒工程技术中心，陕西 杨凌 712100；6.农业部油料产品质量安全风险评估实验室，湖北 武汉 430062；7.农业部油料作物生物学重点实验室，湖北 武汉 430062；8.农业部生物毒素检测重点实验室，湖北 武汉 430062）

SPE-GC-GC-TOFMS检测油脂中游离甾醇及精 炼废弃油脂的判别

徐宝成1,2,3，张良晓2,4，王 华5,*，杨青青2,6，罗登林3，李培武2,4,6,7,8,*

（1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100；2.中国农业科学院油料作物研究所，湖北 武汉 430062；3.河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471003；4.农业部油料及制品质量监督检验测试中心，湖北 武汉 430062；5.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西葡萄与葡萄酒工程技术中心，陕西 杨凌 712100；6.农业部油料产品质量安全风险评估实验室，湖北 武汉 430062；7.农业部油料作物生物学重点实验室，湖北 武汉 430062；8.农业部生物毒素检测重点实验室，湖北 武汉 430062）

研究开发一种基于固相萃取的植物油中游离甾醇的快速分离及多维气相色谱串联飞行时间质谱检测方法。与普通一维气相色谱相比，14 种游离甾醇及β-香树脂醇的三甲基硅烷化衍生物在多维气相色谱上得到了更好地分离，并且检测灵敏度更高。方 法学验证结果表明：胆固醇、菜籽甾醇、芸薹甾醇和β-谷甾醇的检出限分别为0.03、0.04、0.04 mg/100 g油和0.05 mg/100 g油，定量限分别为0.06、0.08、0.08 mg/100g油和0.08 mg/100g油，在不同添加水平条件下的加标回收率皆高于93%，相对标准偏差在1.4%～10.0%之间。同时，利用本方法对6 种商品植物油及25 份精炼废弃油脂中的游离甾醇进行检测，并分析其在植物油和废弃油脂中的分布模式，提出了以判别指数对废弃油脂进行鉴别的方法，结果显示25 份精炼废弃油脂被完全正确识别。

多维气相色谱-飞行时间质谱；固相萃取；游离甾醇；精炼废弃油脂；判别

甾醇属于三萜烯类化合物，是油料作物的一组特异性次生代谢物，它们在植物油中的含量和组成能够反映食用油的种类[1-2]。植物甾醇在油脂中以游离态和结合态2 种形式存在，其中结合态又可以分为甾醇脂肪酸酯、甾醇酚酸酯、甾基糖苷以及酰化甾基糖苷4 类[3-4]。目前，植物油中甾醇的测定一般先将油脂进行皂化，然后再进行分离检测，这种方法测得游离态和甾醇酯类的含量之和[5-11]；另一种方法则是先 将油脂进行酸、碱水解，再进行甾醇的分离检测，可测得4 类甾醇总含量[12]。然而关于油脂中14 种游离甾醇的分离及检测方法则未见报道。

每种植物油都具有特征性的甾醇组成，其组成模式是鉴定食用油真伪的重要依据。Gázquez-Evangelista等[13]利用离线预处理高效液相色谱结合气相色谱-火焰离子检测器（high performance liquid chromatographygas chromatography-flame ionization detector，HPLC-GCFID）检测不同植物油中甾醇的含量并建立了其指纹图谱，成功地对特级初榨橄榄油、橄榄果渣油、葵花籽油和大豆油进行区分和鉴别。然而，上述方法需要复杂的样品前处理包括皂化、不皂化物的萃取等步骤，过程费时费力且消耗大量的有机溶剂。为了使甾醇信息更好地应用于食用植物油的保真与掺伪鉴别，本研究基于固相萃取（solid phase extraction，SPE）及多维气相色谱串联飞行时间质谱（multidimensional gas chromatography coupled to time-of-flight mass spectrometry，GC-GCTOFMS），开发了一种新的植物油游离甾醇的快速分离及检测方法，并对常见6 种植物油及25 份精炼废弃油脂（refined waste oil，RWO）进行了检测；同时通过对6 种常见植物油及精炼废弃油脂样品中14 种游离甾醇及β-香树脂醇的分布模式及含量的分析，提出用判别指数（discriminated index，DI）鉴别精炼废弃油脂，为精炼油脂的鉴别提供一种参考方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

商品大豆油（12 种）、花生油（18 种）、菜籽油（7 种）、葵花籽油（10 种）、玉米胚芽油（7 种）中国检验检疫科学研究院；商品大豆油（11 种）、菜籽油（15 种）、葵花籽油（5 种）、玉米胚芽油（5 种）、棉籽油（10 种） 市购；精炼废弃油脂25 份 国家食品安全与风险评估中心。以上油脂样品避光、贮藏在4 ℃的环境中，以供分析。

胆固醇（3β-cholest-5-en-3-ol，纯度99%）、胆甾烷醇（5α-cholestan-3β-ol，分析纯）、菜油甾醇（[24S]-24-methyl cholesta-5,22-dien-3β-ol，分析纯）、芸薹甾醇（[24R]-24-methyl chole st-5-en-3β-ol，纯度98%）、豆甾醇（[24S]-24-ethyl cholesta-5,22-dien-3β-ol，纯度95%）、β-谷甾醇（[24R]-24-ethyl cholest-5-en-3β-ol，纯度≥97%）和N-甲基-N-三甲基硅烷七氟丁酰胺（N-trimethylsilyl-N-methylheptafluorobutyramide，MSHFBA） 美国Sigma-Aldrich公司；1-甲基咪唑（纯度99.0%） 国药集团化学试剂有限公司；正己烷（色谱纯）、乙醚（分析纯） 天津天力化学试剂有限公司；无水硫酸钠（分析纯） 天津市东丽区天大化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

多维气相色谱-飞行时间质谱（配有Pegasus 4D GC×GC-TOFMS软件，版本为4.43.3.0） 美国Leco公司；一维毛细管色谱柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、二维毛细管色谱柱：DB-17ht（1.5 m× 0.10 mm，0.15 μm） 美国安捷伦公司；ASPEC XL型-固相萃取仪 美国Gilson公司；旋转蒸发仪 德国Heidolph公司；固相萃取柱（二氧化硅，0.5 g/6 mL）北京迪马科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 游离甾醇的分离

上样液的制备：准确称取0.05g（精确到小数点后4 位）油样，并加入20 μg胆甾烷醇内标，然后用5 mL正己烷溶液溶解，涡旋振荡均匀，备用。

SPE柱的活化：称取1.0 g无水硫酸钠加到SPE柱的上方，然后用10 mL正己烷溶液活化，流速1.5 mL/min，弃去流出液；上样：将5 mL样品液注入到SPE柱中，控制流速1.2 mL/min，弃去流出液；淋洗：用10 mL体积分数5%乙醚-正己烷溶液进行淋洗，除去甘油三酯和甾醇酯类化合物，流速控制在1.2 mL/min，弃去流出液；洗脱：用10 mL体积分数为20%乙醚-正己烷溶液洗脱游离甾醇并收集于洁净干燥的试管中，流速控制在1.5 mL/min。

1.3.2 甾醇的甲基硅烷化衍生

根据ISO 12228∶1999 Animal and vegetable fats and oils-determination of individual and total sterols contents-gas chromatographic method[14]的方法，对1.3.1节中得到的甾醇类化合物进行硅烷化衍生。将1.3.1节中得到的10 mL洗脱液在40 ℃真空旋转蒸发至大约1 mL，然后转移到反应瓶中，用氮气缓缓吹干溶剂，再加入100 μL硅烷化试剂（MSHFBA∶1-甲基咪唑=95∶5，V/V），旋紧反应瓶盖，放于105 ℃恒温箱中反应15 min，然后冷却至室温供分析。

1.3.3 色谱条件

多维GC分析中包含2 根毛细管色谱柱，其中一维柱为HP-5MS，二维柱为DB-17ht。进样口温度320 ℃；载气为氦气；流速0.8 mL/min；进样量1 μL；分流比20∶1。一维炉温箱的升温程序：初始温度190 ℃，保持1 min，然后以5 ℃/min升到305 ℃，并保持25 min；二维炉温箱的温度比一维炉温箱高10 ℃，升温程序保持一致。调制器温度补偿25 ℃。

1.3.4 质谱条件

电子电离源；电子能量70 eV；传输线温度300 ℃；检测器电压1 750 V；离子源温度250 ℃。质谱数据采集频率10 次/s；扫描质量数m/z 50～600；溶剂延迟600 s。实验数据的处理使用LECO公司Pegasus 4D GC×GCTOFMS软件，版本为4.43.3.0。

1.3.5 定性和定量分析

定性分析：根据各甾醇的相对保留时间（relative retention times，RRTs，以胆固醇为基准，其中胆固醇的RRT为1.000），并将其质谱图与NIST谱库的标准质谱图进行比对，对油脂样品中的甾醇进行定性。各甾醇三甲基硅醚的相对保留时间和重要定性离子如表1所示。

定量分析：对于不饱和的甾醇采用内标法进行定量，标准曲线的每个质量浓度点各加20 μg内标，其中胆固醇、菜油甾醇、芸薹甾醇以及β-谷甾醇内标曲线的质量浓度梯度分别为：0.1、0.2、0.4、0.8、1.5、3.0 μg/100 μL；0.1、1、5、10、20、30 μg/100 μL；1、5、10、20、30、40 μg/100μL；10、20、40、80、120、140 μg/100μL；豆甾醇的质量浓度梯度与芸薹甾醇相同。对于油样中的β-香树脂醇和其他不饱和甾醇（24-亚甲基胆固醇、Δ7-芸薹甾烯醇、Δ5,23-豆甾二烯醇、Δ5-燕麦甾烯醇、Δ5,24-豆甾二烯醇、Δ7-豆甾烯醇和Δ7-燕麦甾烯醇），其含量的估算统一使用豆甾醇内标曲线，曲线中豆甾醇的质量浓度梯度为0.1、0.5、1、2、4、8、16 μg/100μL。油脂样品中饱和甾醇（芸薹甾烷醇、谷甾烷醇）在结构上和内标相似度最高，因此通过和样品中内标直接相比后便可计算其含量，响应因子为1.0。各甾醇三甲基硅醚的定量离子组合如表1所示。油脂样品中游离甾醇含量以mg/100 g表示，每个样品独立平行测定3 次，以其平均值做进一步的数据分析。

表 1 甾醇三甲基硅烷化衍生物的GC-GC-TOFMS分析结果Table 1 GC-GC-TOFMS results of trimethylsilyl sterol ethers

1.3.6 方法验证

空白油样的获得：根据1.3节中样品前处理的方法，将500 mg花生油溶解于5 mL正己烷中，然后进行上样和淋洗，并将5 mL上样流出液和10 mL淋洗流出液收集于洁净干燥的试管中，然后将其浓缩至5 mL，作为第2次处理的上样液。以同样的步骤进行第2、第3次和第4次处理，并将第4次的上样流出液和淋洗流出液（共计15 mL）收集于洁净干燥的试管中，再用氮气缓缓将溶剂吹干，得到空白的花生油样。该空白油样经检测未发现游离甾醇，然后将其转移到棕色玻璃瓶中，密封后避光贮藏在—28 ℃的冰箱中，备用。

方法的检出限（limit of detection，LOD）、定量限（limit of quantifi cation，LOQ）、线性范围、重复性和回收率实验根据分析方法验证标准进行[15]。

2 结果与分析

2.1 GC-GC-TOFMS分析

油脂样品中的游离甾醇经过SPE分离和硅烷化衍生后用GC-GC-TOFMS进行分析，结果表明：14 种游离甾醇和β-香树脂醇的硅烷化衍生物在HP-5MS串联DB-17ht的二维GC上可以得到很好地分离，如图1所示。和Toledano等[16]报道的30 m单柱（0.25 mm×0.25 μm，质量分数5%苯基聚甲基硅酮毛细管柱）相比，各甾醇三甲基硅醚在GC-GC上得到了更好地分离；另外，24-亚甲基胆固醇、芸薹甾醇和芸薹甾烷醇在GC-GC上的分离效果也比50 m SE-54单柱（0.25 mm×0.10 μm）的分离效果要好[14]。根据各甾醇三甲基硅醚的RRTs和MS数据，可以对油脂样品中的游离甾醇逐一确定，结果如表1所示。不同于其他文献[17-22]报道，本研究可以同时分离和检测植物油中14 种游离甾醇（表1）和一种甾醇类似物（β-香树脂醇），并通过分析它们在不同油脂中的含量及分布模式，寻找精炼废弃油脂和正常食用植物油的差别。

图 1 大豆油（17号样品）中游离甾醇SPE萃取物经过硅烷化衍生后的多维气相色谱-飞行时间质谱色谱图Fig.1 GC-GC-TOFMS chromatogram of silylated fre e sterols extracted from soybean oil (sample 17) by SPE

2.2 方法验证

根据方法学验证标准[15]，按照质量浓度从高到低的原则依次向空白花生油样中添加代表性甾醇进行方法的LOD和LOQ实验，结果见表2。由于各游离甾醇在不同种类油脂样品中的含量有较大的差异，因此各标准曲线建立时应根据其在样品中的实际含量范围选择合适的质量浓度梯度（如本研究1.4节定量分析所述），数据经回归拟合后得到各游离甾醇的计算公式，其相关系数（R2）都不小于0.997 3，表明在整个定量质量浓度范围内GCGC-TOFMS的响应都具有较好的线性关系。为了验证整个方法的准确度和重复性，将胆固醇、菜籽甾醇、芸薹甾醇以及β-谷甾醇在3 个不同质量浓度水平（低、中、高）分别添加到空白花生油中，然后经过SPE分离和硅烷化衍生后进行GC-GC-TOFMS分析，并计算各甾醇在不同添加水平条件下的回收率和精密度（重复性），结果如表2所示。从表2可以看出，各甾醇在不同添加水平条件下平均回收率都不小于93%，并且其精密度符合方法学验证标准的要求[15]，低质量浓度添加时甾醇实测值的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）最大为10.0%，高质量浓度添加时其RSD最小为1.4%，这也表明本方法具有良好的准确度和重复性。

表 2 方法学验证结果Table 2 Validation of the established method

2.3 常见植物油和精炼废弃油脂样品分析

表 3 典型大豆油中游离甾醇的分布模式及含量Table 3 The distribution mode of free phytosterols and their contents in typical soybean oil

为确保在日常检测中方法的稳定性，在每天进行正式样品检测前需先进行质控（quality control，QC）样品的测定，每次独立平行测定3 次，考察回收率和精密度。QC样品是在空白花生油中分别添加一定量的菜籽甾醇（35 mg/100 g）、芸薹甾醇（35 mg/100 g）、豆甾 醇（35 mg/100g）和谷甾醇（140 mg/100g）而制得。结果表明，在整个样品检测期间，QC样品中各甾醇的平均回收率不小于97%，各甾醇实测值的RSD小于3%（n=3），表明方法的稳定性较好。在本研究的实验条件下对所有油脂样品进行了分析，其中典型大豆油游离甾醇分布模式及含量如表3所示。从表3可以看出，大豆油中主要的游离甾醇是β-谷甾醇、豆甾醇和芸薹甾醇，另外还含有一定量的Δ5-燕麦甾烯醇、β-香树脂醇、Δ7-豆甾烯醇和谷甾烷醇，而其他甾醇的含量则较低，这和Lechner等[23]的报道是一致的。

为能够正确区分和识别精炼废弃油脂，本研究对6 种商品植物油及25 份精炼废弃油脂中14 种游离甾醇及β-香树脂醇的分布模式及含量进行了分析，找到3 种关键性游离甾醇，分别是胆固醇、Δ5-燕麦甾烯醇和Δ5,24-豆甾二烯醇。同时，提出DI，即：正常食用油（或精炼废弃油脂）中的Δ5-燕麦甾烯醇和Δ5,24-豆甾二烯醇二者含量之和与其胆固醇含量的比值。通常来讲，因反复加热和过度精炼以及引入动物油脂成分的缘故，精炼废弃油脂中Δ5-燕麦甾烯醇和Δ5,24-豆甾二烯醇的含量通常会降低而胆固醇含量则会升高，因此DI更能突出废弃油脂和正常食用油之间的差别。本研究中6 类常见植物油及25 份精炼废弃油脂样品的关键游离甾醇含量及DI值如表4所示。

表 4 6 类常见植物油及精炼废弃油脂（RWOs）样品的关键游离甾醇含量及DI值Table 4 The contents of key free phytosterols and DI values of six common vegetable oils and the refifi ned waste oils (RWOs)

从表4可以看出，在6 种植物油中胆固醇含量最高的是棉籽油，平均为1.25 mg/100g，而葵花籽油中胆固醇的含量最低，平均为0.26 mg/100g。若以胆固醇含量作为精炼废弃油脂的判别指标并考虑到误判风险，可以将判定阈值设为2.0 mg/100g。从表4可知，在25 份精炼废弃油脂中共有15 份样品的胆固醇含量大于2.0 mg/100g，其中含量最高的是RWO21，胆固醇为146.80 mg/100g。但是由于精炼废弃油脂来源广泛、成分复杂，一些煎炸老油胆固醇含量低于判定阈值[24-25]，此时利用胆固醇作为判定指标漏检率较高。而本研究提出的DI值可以大大降低假阳性和假阴性。各种植物油中葵花籽油的DI值最大，平均为64.55；而大豆油、菜籽油和棉籽油的DI值比较接近，分别为9.37、10.31和9.25。从理论上来讲，以上6 种植物油之间任意进行调配，其DI值都应该不小于棉籽油的DI值，因此本研究将精炼废弃油脂的判定DI值设为6，对于DI小于6的样品可以判为精炼废弃油脂，对于DI在6～9之间的样品则需要进一步分析其完整游离甾醇信息，或者结合其他方法进行判定。25 份精炼废弃油脂的DI值都小于6，其中最小值为0，最大值为5.49，和正常植物油相比具有显著性差异。对RWO15（DI=5.49）的游离甾醇进行进一步分析可以发现：该样本具有较高的豆甾醇（27.54 mg/100 g）和相对较高的谷甾烷醇（1.03 mg/100 g），可以判定该样本应该是大豆源的精炼废弃油脂。本研究结果显示，DI值在精炼废弃油脂判定中具有较广泛的适应性和较高的正确率。

3 结 论

本研究开发了1 种植物油中游离甾醇的SPE-GC-GCTOFMS检测方法，与普通一维GC比，游离甾醇及β-香树脂醇的三甲基硅烷化衍生物在多维GC上得到了更好地分离。同时，加标回收实验和精密度实验表明：该方法准确度高、重复性好，符合方法学验证标准的要求。最后，利用本方法对6 种商品植物油及25 份精炼废弃油脂中游离甾醇进行了检测，并分析其在植物油和废弃油脂中的分布模式及含量，提出了基于DI的废弃油脂鉴别方法，结果显示25份精炼废弃油脂被完全正确识别，可以作为精炼废弃油脂鉴别的一种参考方法。

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A Method for Determination of Free Phytosterols Derived from Vegetable Oils by SPE-GC-GC-TOFMS and Its Application for Discrimination of Refi ned Waste Oils

XU Baocheng1,2,3, ZHANG Liangxiao2,4, WANG Hua5,*, YANG Qingqing2,6, LUO Denglin3, LI Peiwu2,4,6,7,8,*
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2. Oil Crops Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430062, China; 3. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China; 4. Quality Inspection and Test Center for Oilseeds Products, Ministry of Agriculture, Wuhan 430062, China; 5. Shanxi Engineering Research Center for Viti-Viniculture, College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 6. Laboratory of Risk Assessment for Oilseeds Products, Ministry of Agriculture, Wuhan 430062, China; 7. Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops, Minstry of Agriculture, Wuhan 430062, China; 8. Key Laboratory of Detection for Mycotoxins, Ministry of Agriculture, Wuhan 430062, China)

In this study, a multidimensional gas chromatography coupled to time-of-flight mass spectrometry (GCGC-TOFMS) method was established to determine free sterols in edible oils extracted by rapid solid-phase extraction. Compared with conventional one-dimensional gas chromatography, a better separation and a higher detection sensitivity for trimethylsilyl derivatives of free sterols and β-amyrin were obtained by GC-GC. Meanwhile, the validation results of the established method indicated that the limits of detection for cholesterol, brassicasterol, campesterol and β-sitosterol were 0.03, 0.04, 0.04 and 0.05 mg/100 g of oil, respectively; and the limits of quantification for the four sterols were 0.06, 0.08, 0.08 and 0.08 mg/100 g of oil, respectively. In addition, the recovery rates of the selected four sterols spiked at three different levels were higher than 93% with a relative standard deviation ranging from 1.4% to 10.0%. Based on theestablished method, six types of edible oils and 25 refi ned waste oils were analyzed by GC-GC-TOFMS, and the distribution mode of free sterols in normal vegetable oils and waste oils were also analyzed. Moreover, a method based on discrimination index (DI) was proposed to identify refined waste oils, and the results indicated that the refined waste oils could be discriminated from the normal six edible oils completely.

multidimensional gas chromatography-time-of-flight-mass spectrometry (GC-GC-TOFMS); solid phase extraction (SPE); free phytosterols; refi ned wasted oils; discrimination

TS207.3

A

1002-6630（2015）02-0188-06

10.7506/spkx1002-6630-201502036

2014-07-12

“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAK08B03）；“双打”相关产品检验鉴定方法研究专项（2012104010-4）；

国家自然科学基金青年科学基金项目（21205118）

徐宝成（1976—），男，讲师，博士研究生，研究方向为农产品质量标准与检测技术。E-mail：xbc76@163.com

*通信作者：王华（1959—），女，教授，博士，研究方向为食品安全与质量控制。E-mail：wanghua@nwsuaf.edu.cn

李培武（1961—），男，研究员，博士，研究方向为农产品质量标准与检测技术。E-mail：peiwuli@oilcrops.cn