响应面法优化甘蔗梢提取物中花青素的分离工艺

李新莹，姚 舜

（1.西南民族大学化学与环境保护工程学院，四川 成都 610041；2.四川大学化学工程学院，四川 成都 610065）

响应面法优化甘蔗梢提取物中花青素的分离工艺

李新莹1，姚 舜2

（1.西南民族大学化学与环境保护工程学院，四川 成都 610041；2.四川大学化学工程学院，四川 成都 610065）

在单因素试验的基础上，通过中心组合试验设计原理，运用响应面法优化甘蔗梢提取物中花青素成分的综合分离工艺条件。以pH值、洗脱体积和流速为考察因素，进行三因素三水平试验，并获得多元二次回归方程。结果表明，采用大孔吸附树脂从甘蔗梢提取物中分离花青素成分的最佳工艺条件为：将提取浸膏用蒸馏水溶解后调节pH值为5.51，然后以大孔树脂与提取物干质量之比20∶1上样，通过装填有D141型大孔吸附树脂的层析柱，用体积分数为30%的乙醇溶液以1.59 BV/h流速、3.76 BV洗脱体积洗脱。该条件下花青素含量为91 mg/kg，与理论值接近。

响应面法；甘蔗梢；花青素；分离

响应面分析法是由Box等于20世纪50年代提出的一种优化工艺条件的有效方法，该方法具有实验周期短、得到的回归方程精度高、可研究多因素间交互作用等优点[1-2]，已广泛应用于天然产物提取、药物合成以及微生物培养等工艺参数的优化[3-14]。甘蔗梢作为制糖工业原料前处理工段的废弃物，除了被用作饲料或肥料以外大部分都被丢弃，未得到充分利用。然而，近年来的研究表明，甘蔗中除了含有大量糖以外，还拥有一定数量以花青素为代表的天然活性成分资源[15]。花青素是一种良好的抗氧化活性剂，具有抗肿瘤、抗炎以及保护心血管等生理作用[16-22]。甘蔗梢是获得花青素的有效资源，但目前关于从制糖工业废弃物甘蔗梢中提取分离花青素类抗氧化活性成分的研究鲜有报道，主要集中在甘蔗汁、甘蔗渣发酵生成醇类或提取纤维素和色素等方面。由于甘蔗梢粗提物中含有较多杂质，花青素含量相对较低，因此需要进一步分离纯化。大孔树脂吸附法是天然产物成分分离纯化的常用方法之一，已广泛应用于生化物质的选择性分离[23-26]。本实验对大孔吸附树脂分离甘蔗梢提取物中花青素成分的分离工艺进行研究，通过中心组合试验设计（central composite design，CCD）原理，运用响应面法对分离过程参数进行优化，以期获得最佳的花青素分离工艺条件，为实现制糖工业废弃资源的深度开发和综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甘蔗梢样品采自四川省攀枝花市米易县，经四川华森糖业股份有限公司李玉德高级工程师鉴定被子植物门单子叶植物纲禾本目禾本科甘蔗属植物，所有样品于4℃以下运输及保藏。

矢车菊素-3-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside）标准品 成都曼斯特 生物科技有限公司；D141大孔吸附树脂 中蓝晨光化工研究院；无水乙醇、正丁醇、盐酸等均为国产分析纯；超纯水 美国Millipore公司。

1.2 仪器与设备

TU1810紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；FA/JA型电子天平 上海精密科学仪器有限公司；FW135万能高速粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；KQ-50DE型数控超声波清洗器 昆山超声仪器有限公司；GM-0.33II型隔膜真空泵 天津腾达过滤器件厂；DZF-2B型电热真空干燥箱 北京永光明医疗仪器厂；RE-3000B旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 分离工艺路线

将甘蔗梢粉碎后，以乙醇为提取溶剂，超声波辅助提取3 次，收集多次提取液，浓缩至干，加水溶解，调节上样液pH值后将其通过装填有大孔吸附树脂的层析柱，待充分吸附后，先用蒸馏水洗脱，此部位主要为蔗糖；再用体积分数为30%的乙醇溶液进行洗脱，收集30%乙醇洗脱液，得到花青素部位，按照1.3.2节中方法计算花青素的含量。甘蔗梢中花青素成分分离工艺路线如图1所示。

图 1 甘蔗梢中花青素分离工艺路线Fig.1 Scheme for separation of anthocyanins from sugarcane tips

1.3.2 花青素含量测定

1.3.2.1 标准曲线的绘制

花青素标准曲线的绘制参照文献[27-28]：精密称取66.0mg的cyanidin-3-O-glucoside标准品，用pH 2的正丁醇-盐酸溶液溶解于100mL容量瓶中，定容至100 mL，充分摇匀，得到质量浓度为660.0 mg/L的cyanidin-3-O-glucoside对照品储备溶液，备用。分别精密吸取上述对照品储备溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、1.0 mL置于10 mL容量瓶中，用pH 2的正丁醇-盐酸溶液定容至刻度，摇匀，于95 ℃水浴中冷凝回流40min，迅速在冷水中将其冷却到室温。以空白为对照，使用紫外-可见分光光度仪在516 nm波长处测定不同质量浓度溶液的吸光度，再以溶液的质量浓度为横坐标（X）、吸光度为纵坐标（Y），绘制出总花青素标准曲线，并得到相关回归方程。

1.3.2.2 花青素含量测定

将柱层析后收集的30%乙醇洗脱液浓缩至干，用pH 2的正丁醇-盐酸溶液溶解，于95 ℃水浴中冷凝回流40min，迅速在冷水中将其冷却到室温。以空白为对照，使用紫外-可见分光光度仪在516 nm波长处测定溶液的吸光度，通过回归方程计算花青素含量，见式（1）。

1.3.3 单因素试验

以前期研究为基础进行单因素试验，分别考察了pH值、洗脱体积、流速等因素对甘蔗梢中花青素分离效果的影响。每次取一定量的甘蔗梢提取物（相当于1 000 g甘蔗梢原料提取得到）装入填有D141型大孔吸附树脂的层析柱中，分别以不同pH值（pH 1、3、5、7、9）上样，按提取物与树脂干质量比1∶20上样，充分吸附后，先用蒸馏水洗脱，再用体积分数为30%的乙醇溶液进行洗脱，按不同洗脱体积（1、2、3、4、5 BV）和流速（1、2、3、4、5 BV/h）收集乙醇洗脱液，按照1.3.2节方法计算花青素的含量，并通过含量确定活性成分分离的最佳单因素条件。

1.3.4 响应面法优化

花青素分离过程根据CCD原理，运用Design-Expert 7.1.3软件，在单因素试验的基础上分别考察了对提取量影响较大的pH值、洗脱体积、流速对花青素分离过程的影响，以pH值（X1）、洗脱体积（X2）、流速（X3）3 个因素为自变量，分别代表了5 个水平编码（—1.68、—1、0、1、1.68），共20个试验点。以花青素含量为响应值设计了三因素三水平试验，20 个试验点的响应面分析试验分为14 个析因点和6 个零点，试验因素与水平设计如表1所示。

表 1 花青素分离过程中心组合设计因素与水平Table 1 Factors and levels used in central composite design for anthocyanins separation

试验以随机次序进行，每组试验进行3 次平行操作，计算得到平均响应值通过程序分析，得出响应面分析图、回归拟合方程以及方差分析表，同时通过Design-Expert软件中的程序对试验结果进行响应面分析，经二次回归拟合后求得响应函数，运用公式（2）得出回归方程。

式中：Xi、Xj为独立编码变量；β0为截距的衰减系数；βj为一次相的衰减系数；βjj为二次相的衰减系数；βij为交互相的衰减系数。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

图 2 pH值对洗脱液中花青素含量的影响Fig.2 Effect of sample pH on the anthocyanins content

2.1.1 pH值对分离效果的影响调节上样液pH值分别为1、3、5、7、9，以洗脱体积和流速分别为3 BV和2 BV/h进行柱层析后，通过花青素标准曲线回归方程（Y=0.000 7X+0.007 9，R2=0.999 6）检测洗脱液中花青素含量。由图2可以看出，在洗脱体积和流速一定的条件下，随着pH值的升高，花青素含量先增大后减小，且pH 5时花青素成分含量最高，当pH值大于7后洗脱液中花青素含量呈下降趋势，说明弱酸性条件更利于花青素成分的吸附及分离，因此选择pH 5为最佳条件。

2.1.2 洗脱体积对分离效果的影响

图 3 洗脱体积对洗脱液中花青素含量的影响Fig.3 Effect of elution volume on the anthocyanins content

选用不同的洗脱体积（1、2、3、4、5 BV），上样液pH 5、流速2 BV/h条件下进行柱层析，检测洗脱液中花青素含量，考察不同洗脱体积对甘蔗梢提取物中花青素分离效果的影响。由图3可以看出，在pH值和流速一定的条件下，随着洗脱体积的升高，花青素含量是逐渐增大的，当洗脱体积超过3 BV后花青素的洗脱量基本没有变化，再增加洗脱体积对花青素洗脱量的提高影响不显著，考虑到洗脱溶剂量过多会增加后续浓缩的负担，因此选择洗脱体积为3 BV最佳。

2.1.3 流速对分离效果的影响

图 4 流速对洗脱液中花青素含量的影响Fig.4 Effect of elution fl ow rate on the anthocyanins content

选用不同的洗脱流速（1、2、3、4、5 BV/h），上样液pH 5、洗脱体积3 BV条件下进行柱层析，检测洗脱液中花青素含量，考察不同流速对甘蔗梢提取物中花青素分离效果的影响。由图4可以看出，在pH值和洗脱体积一定的条件下，随着流速的升高，花青素含量先增大后减小，当流速超过2 BV/h后花青素含量反而减小，且花青素含量减小的趋势较为明显，说明流速过快不利于花青素成分的分离，因此选择2 BV/h为最佳流速。

2.2 响应面法优化结果

选择pH值、洗脱体积和流速为自变量，考察了各因素对花青素分离过程的影响，响应面分析方案与结果如表2所示。通过多项式回归分析对实验数据进行回归拟合，得到了花青素含量与各因素变量间的多项式方程：

为了说明回归方程的有效性及各因素对分离得到花青素量的影响程度，对回归方程进行了方差分析。由表3可以看出，流速（X3）对大孔吸附树脂分离花青素有较为显著的影响；洗脱体积的影响不显著（P＞0.05）。二次项中的pH值和流速对大孔吸附树脂分离花青素的影响达到极显著的水平（P＜0.000 1）；交互项中pH值和流速（X1X3）对大孔吸附树脂分离花青素影响达到极显著水平（P＜0.000 1），其余交互项对分离无影响。此模型的决定系数R2为0.960 1，经拟合检验可知，差异极显著（P＜0.000 1），表明该方程对试验拟合情况良好，误差小，能够正确反映大孔吸附树脂分离甘蔗梢花青素与pH值、洗脱体积、流速之间的关系；失拟项不显著（P＞0.05），说明本试验无其他因素的显著影响，可以用此模型对大孔吸附树脂分离花青素进行分析和预测，模型是有效的。

表 2 花青素分离响应面试验方案与结果Table 2 Central composite design and response values for anthocyanins separation

图 5 pH值和洗脱体积对大孔吸附树脂分离甘蔗梢花青素影响的响应面及等高线图Fig.5 Response surface plot and contour plot showing effects of sample pH and elution volume as well as their interaction on the anthocyanins content

图 6 pH值和流速对大孔吸附树脂分离甘蔗梢花青素影响的响应面及等高线图Fig.6 Response surface plot and contour plot showing effects of sample pH and elution fl ow rate as well as their interaction on the anthocyanins content

图 7 洗脱体积和流速对大孔树脂分离甘蔗梢花青素影响的响应面及等高线图Fig.7 Response surface plot and contour plot showing effects of elution volume and elution fl ow rate as well as their interaction on the anthocyanins content

如图5所示，等高线可以直观地看出两因素交互作用显著，当洗脱体积一定时，分离得到花青素的量随pH值的增加而增加，当pH值超过5时，花青素含量随pH值的增加而减小。如图6所示，等高线可以直观地看出两因素交互作用显著，随着pH值和流速的增加，大孔吸附树脂分离得到花青素含量先增大后缓慢减少。在pH 5、流速2 BV/h附近时，大孔吸附树脂分离得到花青素含量达到最大值。如图7所示，等高线可以直观地看出两因素交互作用显著，当洗脱体积一定时，随着流速的增加，大孔吸附树脂分离得到花青素含量先增大后缓慢减小，在洗脱体积3 BV、流速2 BV/h附近时，大孔吸附树脂分离得到花青素含量达到最大值，且分离得到花青素的量对流速的变化比对洗脱体积的变化敏感。

根据所得到的模型，结合统计软件分析可以预测在稳定状态下甘蔗梢中花青素的最佳分离条件为pH 5.51、洗脱体积3.76 BV、流速1.59 BV/h，在此条件下理论上花青素含量应为92 mg/kg。为了验证模型方程的合适性和有效性，在试验水平范围内，进行了最佳花青素分离条件的验证实验，结果表明，大孔吸附树脂分离得到花青素含量为91 mg/kg，与理论值相近，证明此模型是合理有效的，具有较好的实践指导意义。

3 结 论

本研究采用响应面法优化了甘蔗梢中花青素类成分的分离工艺条件，分别考察了pH值、洗脱体积、流速等因素对甘蔗梢中花青素成分分离效果的影响，并得到从甘蔗梢中分离花青素成分的最佳工艺条件为：调节上样液pH 5.51，以大孔树脂与提取物干质量之比20∶1上样，通过装填有D141型大孔吸附树脂的层析柱，先用蒸馏水洗脱后，再用体积分数为30%的乙醇溶液以1.59 BV/h流速、3.76 BV洗脱体积来进行洗脱。该条件下花青素含量为91 mg/kg，与理论值相近。本实验将为进一步制备较高纯度花青素单体奠定基础，以期为制糖工业废弃物的深度开发和综合利用提供参考。

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Optimizing Conditions for Separation of Anthocyanins from Sugarcane Tip Extracts Using Response Surface Methodology

LI Xinying1, YAO Shun2
(1. College of Chemistry and Environment Protection Engineering, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China; 2. School of Chemical Engineering, Sichuan University, Chengdu 610065, China)

A central composite design was used to investigate the best conditions for separation of anthocyanins from sugarcane tip extracts. In the separation procedure, the independent variables studied were pH value, elution volume, and fl ow rate. Using anthocyanins content as the response variable, a multivariable quadratic regression equation was developed. The optimal separation conditions for anthocyanins from sugarcane tip extracts were determined as follows: the extract was distilled with water followed by pH adjustment to 5.51 and loaded onto a column packed with D141-type resin with a resin-to-extract (dry weight) ratio of 20:1, and then the column was eluted with 3.76 BV of 30% aqueous ethanol at a fl ow rate of 1.59 BV/h. The anthocyanins content of the purifi ed product obtained was 91 mg/kg, which was similar to the predicted value.

response surface methodology; sugarcane tips; anthocyanins; separation

TS249；O629

A

1002-6630（2015）02-0007-05

10.7506/spkx1002-6630-201502002

2014-06-21

国家自然科学基金青年科学基金项目（81102344）；国家自然科学基金面上项目（81373284）

李新莹（1984—），女，讲师，博士，研究方向为天然产物化学。E-mail：lixinying1984@163.com