当归芍药散加味方对乳腺增生模型大鼠乳腺上皮组织ERK表达的影响

张婷婷 ，王 苹，张建伟 ，吴惠燕

（福建中医药大学中医学院，福建 福州350122）

乳腺增生病的发生、发展是乳腺上皮细胞增殖过度和凋亡减弱共同作用的结果。研究［1］证实丝裂原激活蛋白激酶／细胞外信号调节激酶（MAPK／ERK）信号转导通路的异常活化能够导致细胞丧失凋亡和分化的能力，促使细胞异常增殖。通过调控信号传导途径治疗肿瘤、防止癌变，已成为人们日益关注的焦点。我们通过实验观察当归芍药散加味方对乳腺增生模型大鼠乳腺组织中ERK蛋白表达的抑制作用和乳腺组织形态变化，探讨其可能的机制。

1 材 料

1.1 动物及分组50只SPF级SD雌性健康未孕大鼠，体质量（198.58±6.78）g，上海市西普尔必凯实验动物有限公司提供，福建中医药大学动物实验中心代购，许可证号：SCXK（沪）2008－0016，合格证号：2008001601331。适应性喂养1周后，随机分为正常对照组10只，实验组40只。造模30d后，实验组再随机分为模型组、当归芍药散加味方组、乳癖消组，每组10只。实验场所在福建中医药大学动物实验中心，许可证号：SYXK（闽）2009－0001。

1.2 药物和试剂 ① 当归芍药散加味方（自拟）：当归15g，白芍15g，川芎8g，茯苓10g，白术15g，泽泻10g，浙贝母12g，柴胡8g，香附12g，丹参15g。将生药经蒸馏水浸泡1h，文火煎煮2次，每次60min，取汁合并，4层纱布过滤2次，70℃～80℃水浴浓缩至240%浓度的药液（含生药2.4g／mL），冰箱储存备用。②苯甲酸雌二醇注射液（1mL：2mg）。③黄体酮注射液（20mg／mL）。④乳癖消片（0.32g／粒×60粒）。⑤10%水合氯醛溶液。⑥S－P试剂盒，ERK抗大鼠，苏木素染色，中性树胶，多聚赖氨酸。

2 方 法

2.1 造模方法 除正常对照组外，其余3组用雌、孕激素序贯法造模，按体质量0.5m g／（k g／d）于大鼠后肢后外侧肌肉注射苯甲酸雌二醇，每日1次，左右交替，连续25d；继而用黄体酮注射5m g／（k g／d），每日1次，连续5d。正常对照组肌肉注射生理盐水0.1m L／只，每日1次，连续30d。

2.2 给药方法 模型组与正常对照组大鼠按1 m L／（k g／d）生理盐水灌胃；治疗组用当归芍药散加味方制成汤剂，按24g／k g的生药提取液灌胃30d；乳癖消组按成人剂量9粒（2.88g／d）的6.25倍，即0.3g／k g乳癖消片以生理盐水研磨配成混悬液灌胃30d。

2.3 标本采集 4组大鼠灌胃30d后，禁食24h，处死大鼠并经乳头向基底部最大面积取下第二、三对乳房，标本经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，4μm连续切片，待做组织学观察和免疫组化检测。

2.4 检测方法

2.4.1 病理学观察 常规取材、固定、脱水、石蜡包埋切片，HE染色，光学显微镜下观察乳腺组织切片的组织学变化。

2.4.2 ERK检测 用S－P法检测乳腺上皮组织ERK蛋白表达。乳腺组织一部分切片脱蜡水化，20 g／m L蛋白酶K消化20min，3%H2O2阻断，加入ERK一抗过夜，按S－P试剂盒要求步骤进行操作，DAB显色，苏木素复染，干燥封片。

2.5 结果判定

2.5.1 病理学观察 光学显微镜下观察4组大鼠乳腺小叶、腺泡、导管、纤维组织增生情况。

2.5.2 ERK表达 在光学显微镜下ERK蛋白阳性表达为细胞核和（或）细胞浆着棕黄色，任选取5个最佳视野进行拍照，将照片在同一条件下用美国MediaCybernetics公司专业图片分析软件Image－ProPlus6.0进行免疫组化光密度测定，取上述5个视野的均值为该检测样本的ERK平均光密度值。

3 结 果

3.1 4组ERK表达比较 见表1。

表1 4组ERK表达比较（±s）

表1 4组ERK表达比较（±s）

注：与正常对照组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05；与乳癖消组比较，3）P＜0.05。

组 别 大鼠／只 ERK／%1013.39±1.74模 型 组 1041.98±3.481）乳癖消组 1028.86±2.061）2）当归芍药散加味方组 1022.48±3.101）2）3）正常对照组

3.2 乳腺组织变化 空白对照组：乳腺小叶比较少见，乳腺小导管及腺泡上皮细胞未见增生；乳腺间质未见纤维组织增生；皮肤附件基本正常，见图1。模型组：乳腺组织出现明显的增生，乳腺小叶体积增大，分叶增多，腺泡数目增多，管腔中可见脱落的上皮细胞及其分泌物，纤维组织增生。证明乳腺增生造模成功，见图2。乳癖消组：乳腺组织增生程度较轻，乳腺导管上皮排列基本规则，腺泡腔和腺导管腔无扩张，腔内分泌物较少，小叶体积缩小，小叶中腺泡数减少，纤维结缔组织增生减轻，见图3。当归芍药散加味方组：乳腺组织轻度增生，乳腺导管上皮排列基本规则，未见明显的腺泡腔和腺导管腔扩张，腔内分泌物减少，小叶体积缩小，小叶中腺泡数也明显减少，纤维结缔组织增生明显减轻；皮肤组织附件基本正常，见图4。

4 讨 论

4.1 ERK表达的意义 实验结果显示，乳腺增生大鼠模型中存在着ERK的阳性表达，给药30d后当归芍药散加味方组和乳癖消片组ERK的阳性表达率减弱，与模型组比较有显著差异（P＜0.05），当归芍药散加味方组优于乳癖消片组。提示乳腺增生存在着ERK的阳性表达，当归芍药散加味方能抑制模型大鼠乳腺组织ERK阳性表达。

4.2 当归芍药散加味方的组方与作用机理分析

当归芍药散出自张仲景的《金匮要略》，治疗肝脾失调、血郁湿滞的腹痛。方由当归、白芍、川芎、茯苓、泽泻、白术组成。方中重用白芍配当归、川芎以调肝；茯苓、泽泻、白术健脾除湿以治脾。全方使肝血足则气条达，脾运健则湿邪除。本实验在原方基础上加了浙贝母、柴胡、香附、丹参4药，浙贝母苦寒，开泄力大，化痰散结作用较强，常用于瘀结阻滞之病。一味丹参功同四物，具有活血调经、祛瘀止痛消痈作用。柴胡疏肝解郁、理气止痛，柴胡与香附相配增强疏肝解郁之功，缓解乳房疼痛的症状，使气机调畅，肝郁得舒；化痰除湿，使脾气健运，生化有权，从而达到调整全身脏腑的功能；佐以活血化瘀、散结止痛之品，使得痰湿瘀之邪去除，缓解乳房局部症状，标本兼顾。从实验结果看，乳腺增生模型大鼠中存在ERK的阳性表达，当归芍药散加味方可以降低模型大鼠乳腺组织ERK蛋白表达。文献［2］认为处于活化状态的MAPK通路，诱导细胞增殖、血管新生相关因子的活化，从而打开细胞增殖、血管新生的开关，导致细胞异常增生，此机理可能是导致乳腺增生病发生的原因。ERK作为MAPK／ERK信号转导通路中的重要蛋白，一定程度上反映了此通路的活化程度。当归芍药散加味方能够改善乳腺组织的增生状态，其作用机理可能是通过调理肝脾，化瘀散结，抑制活化的MAPK途径中ERK的高表达，从而关闭细胞增殖及血管新生的开关，抑制乳腺上皮细胞增殖。

［1］高艳艳，吴素慧 .P D 98059对人子宫颈癌细胞株S i h a增殖和凋亡的影响［J］.中国医疗前沿，2011，6（2）：38－39.

［2］王娜，宋卓敏，阮氏水 .益气消癥法对雌激素诱导子宫肌瘤模型豚鼠子宫组织ME K 2、p－ERK蛋白表达的影响［J］.中国中西医结合杂志，2013，33（10）：1408－1411.