UFLC法测定蛇足石杉不同部位的石杉碱甲含量

张方方，郑雅媗，黄小强，谌赛男，吴水生

（福建中医药大学药学院，福建 福州350122）

石杉碱甲是20世纪80年代我国学者从蛇足石杉中分离得到的一种新型石松类生物碱，被广泛用于治疗阿尔茨海默症、重症肌无力，同时又能促智、提高青春期学生的学习记忆功能［1］。目前测定蛇足石杉不同部位提取物中生物碱含量的方法主要为反相高效液相色谱法（R P－HP L C）［2］，尚无超高效液相或超快速液相检测蛇足石杉中石杉碱甲含量的报道。超快速液相色谱（ultrafastliquidchromatography，UFLC）是一种新型液相色谱技术，被广泛应用于快速分析生物制品和中药材中目标化合物的分离［3］。我们用岛津超快速液相色谱仪，通过选用低浓度的乙酸铵缓冲盐溶液作为流动相，以建立一种快速定量分析石杉碱甲含量的方法。

1 仪器与试药

ProminenceUFLCXR超快速液相色谱仪（日本岛津公司）；AcquityuplcbehC18色谱柱（美国Waters公司）；Milli－Q纯水系统（美国Millipore公司）；十万分之一电子天平（美国Ohaus公司）；真空干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）；KQ5200DE超声仪（江苏省昆山市超声仪器有限公司）。石杉碱甲（长沙中仁生物科技有限公司，批号：2012120301）；甲醇（德国默克公司）；水为超纯水；其它试剂为分析纯。

蛇足石杉，2012年7月采自福建省连城县冠豸山，经福建中医药大学药学院中药鉴定教研室杨成梓副教授鉴定为蛇足石杉Huperziaserrata（Thumb.）Trey.

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：AcquityuplcbehC18色谱柱（2.1mmx100mm，1.7μm）；流动相：甲醇（A）和5mmol／L乙酸铵溶液（B，用冰醋酸调pH至6.0）；洗脱程序：0～1min，28%A，1～4.5min，40%A，4.5～10min，28%A；流速：0.15mL／min；检测波长：309nm；柱温：30℃；进样量：5μL。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取石杉碱甲对照品10m g，置10m L瓶中加入甲醇使之溶解，并稀释到刻度，摇匀，作为贮备液，置4℃冰箱中保存，备用。用上述溶液逐级稀释石杉碱甲储备液，配制成质量浓度为1、4、8、12、16、20、24m g／L的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的配制 取蛇足石杉新鲜植株按根、茎、叶分离并洗净，洗净的植物样品于50℃烘干，用研钵充分研碎过40目筛，置烘箱中烘至恒重。精密称取0.1g，加入2%的酒石酸5m L，浸泡过夜，超声提取2h，17000r／min离心10min，取上清液0.22μm微孔滤膜滤过即得。

2.4 线性范围 将配制的不同浓度的对照品溶液重复进样3次，用得到的峰面积并计算平均值。以对照品浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归方程为：

Y＝37850 X－468.8 r＝0.9998

石杉碱甲在1～24m g／L内线性关系良好。

2.5 方法学考察

2.5.1 仪器精密度 取石杉碱甲对照品溶液，按2.1项的色谱条件，重复进样测定6次，计算石杉碱甲峰面积RSD为0.50%，表明仪器的精密度良好。

2.5.2 稳定性考察 精密称取蛇足石杉茎粉末，按2.1、2.3项，同法操作，分别于制备后0、2、4、8、16、24h进样分析，石杉碱甲峰面积RSD为0.40%，表明供试品溶液中石杉碱甲在24h内稳定。

2.5.3 重复性试验 精密称取蛇足石杉茎粉末6份，按2.1、2.3项，同法操作，结果石杉碱甲峰面积RSD为2.36%，表明重复性良好。

2.5.4 加样回收率实验 石杉碱甲对照品溶液用2%酒石酸稀释至20m g／L，精密称取已知含量的蛇足石杉茎粉末0.1g，共6份，加入对照品溶液，按2.1、2.3项，同法操作，计算加样回收率，结果见表1。

2.6 样品测定 按2.3项的方法配制蛇足石杉不同部位供试品溶液，分别按2.1项的方法重复分析3次，通过标准曲线计算蛇足石杉不同部位中石杉碱甲的含量，蛇足石杉叶茎根不同部位的含量为0.1099%、0.1107%、0.0266%，RSD为1.04%、0.85%、1.57%。图1显示实际样品中的石杉碱甲与石杉碱甲对照品的色谱图可以很好地吻合。

表1 石杉碱甲的加样回收率（n＝6）

3 讨 论

3.1 石杉碱甲为碱性化合物，在反相色谱柱上会产生较为严重的拖尾现象。为了改善峰形，提高分离度，我们选择低浓度的乙酸铵作为流动相，用冰醋酸调节流动相的p H值，以石杉碱甲色谱峰的保留时间、峰面积及拖尾因子作为考查指标，发现低浓度的乙酸铵对蛇足石杉不同部位提取物仍有很好的分离效果，当用冰醋酸调节的乙酸铵p H值在6.0时，石杉碱甲可以得到较好的峰形且拖尾因子值基本稳定，从而建立最佳色谱条件。

3.2 测定结果表明蛇足石杉不同部位的石杉碱甲含量呈茎＞叶＞根的分布规律，这与杜次［4］等的研究结果不同，推测石杉碱甲在蛇足石杉的叶中合成后通过茎向地下部根中运输［5］。由于植物的生物碱、萜类等次生代谢产物能够抵御外界紫外线、蒸发、寒冷等不利理化条件环境，其在植株各部位间的分配遵循最佳防御规律，因此在同一植物的不同部位的浓度也有差异［6］。

［1］王许杰，章海燕 .石杉碱甲改善认知功能的临床研究进展［J］.中国新药与临床杂志，2012，31（12）：707－712.

［2］张敬彩，魏杰，钟虹敏，等 .高效液相色谱法定量测定中药千层塔提取物中的石杉碱甲［J］.色谱，2013，31（1）：79－82.

［3］李芙蓉，陈世忠，罗世恒，等 .UFLC法测定茜草中羟基茜草素和大叶茜草素［J］.中草药，2010，41（12）：2087－2089.

［4］杜次，李菁，田向荣，等 .湘西蛇足石杉不同部位石杉碱甲分布及与L D C 表达的关系［J］.中药材，2013，36（3）：361－364.

［5］杜次，彭清忠，田向荣，等 .湘西蛇足石杉中石杉碱甲乙和丙含量的测定［J］.广西植物，2013，33（3）：406－409.

［6］闫凤鸣 .化学生态学［M］.2版 .北京：科学出版社，2011：74－86.

［7］周小雷，袁经权，王硕，等 .H P L C法测定不同季节千层塔中石杉碱甲和石杉碱乙含量［J］.中华中医药杂志，2013，28，（2）：504－506.