福建不同产地三叶青叶中总黄酮含量比较

范世明，陈 琳，林 婧，于虹敏，黄学城，许 文，3，陈 丹，黄泽豪

（1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；3.福建中医药大学生物医药研发中心，福建 福州350122）

三叶青是我国特有的珍稀药用植物，又名三叶崖爬藤（Tetrastigmahemsleyanum Dielset Gilg），为葡萄科崖爬藤属植物，主要分布于我国南方的浙江、江西、福建、广东、广西、云南、海南、台湾等省区，其块根在民间被广泛药用。据《全国中草药汇编》中记载：“三叶青，味苦性平。具有清热解毒，祛风化痰，活血止痛的功效。”［1］据报道［2］三叶青中的化学成分有黄酮、还原糖、甾类化合物、氨基酸等，其中黄酮是重要的生理活性物质。现代药理研究表明三叶青总黄酮部位具有抗肿瘤细胞增殖、诱导凋亡等作用［3－5］。文献［6］表明，三叶青的叶（或全株）在民间也供药用，如《海南植物志》中记载三叶青全株可用于白喉、风湿性腰痛等。《中国植物志》［7］中也记载全株供药用。《台湾药用植物图鉴》中记载其鲜叶捣碎可以治皮肤病［8］。目前不同产地的三叶青块根总黄酮含量测定方法已有报道［9－10］，但未见三叶青叶的质量评价报道，三叶青地上部分化学成分定性鉴别的结果表明，黄酮是其主要成分之一［11］。因福建的顺昌、泰宁、福安等地已开始大量种植三叶青，有必要建立测定三叶青叶中总黄酮含量的方法，为三叶青叶的品质评价提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 UV 9100紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；SartoriusCPA225 D十万分之一电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；KQ－500 E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；

1.2 试药 三叶青叶2013年8月～12月实地采自福建顺昌、泰宁、福安等地，采下叶片（带叶柄），晾干；部分购自浙江台州、丽水等地，经福建中医药大学中药鉴定教研室卢伟教授鉴定为葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤Tetrastigmahemsleyanum Dielset Gilg.的干燥叶。芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110774－201113）；甲醇（德国 Merck公司，色谱纯）；水为超纯水（美国m illipore公司）；其它试剂为分析级。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备 精密称取芦丁对照品，用甲醇制成每1m L含芦丁0.402m g的对照品溶液，即得。

2.2 供试品溶液制备 取三叶青叶供试品，粉碎过40目筛，取粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇50m L，精密称定，超声（250 W，40k H z）处理30min，放冷，精密称定后用甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 总黄酮的显色方法及测定波长 参考文献［9］测定方法，精密吸取供试品、对照品溶液各4m L分别置25m L量瓶中，分别加甲醇至10m L，按下述显色方法显色：加入15%新鲜配制的亚硝酸钠溶液1 m L，10%硝酸铝溶液1m L，摇匀后放置6min，加入10%新鲜配制氢氧化钠溶液10m L，用甲醇定容，摇匀后放置15min，即得对照品显色溶液及供试品显色溶液。上述2种显色溶液分别以同样处理的空白显色体系为参比，在410～800n m波长处扫描，对照品与样品紫外吸收基本一致，最大吸收波长在500 n m，故选择500n m为比色测定波长。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性范围 精密吸取对照品溶液1、2、4、6、8、9m L到25m L量瓶中，加甲醇至10m L，制备得不同梯度浓度的对照品溶液，按2.3项显色，各对照品显色体系，以同样处理的空白显色体系为参比，在500n m波长处测定吸光度，以吸光度A对浓度C进行回归计算，得线性回归方程：

A ＝0.0057 C＋0.0410 r＝0.9994

线性范围为16.08～144.72μg／m L。

2.4.2 精密度试验 精密移取对照品溶液和供试品溶液各4m L，分别置于25m L量瓶中，按2.3项分别显色，在紫外分光光度计上连续测定6次，结果对照品和供试品显色产物吸光度的RSD为0.21%、0.27%。

2.4.3 重复性试验 精密称取同批三叶青的叶样品1g，6份，按2.2项制成供试品溶液，精密吸取4 m L，按2.3项显色，测定吸光度并根据标准曲线计算，得该批次三叶青中总黄酮平均含量2.69%，RSD 2.09%。

2.4.4 稳定性试验 精密移取对照品溶液和供试品溶液各4m L，分别置于25m L量瓶中，按2.3项显色处理后，在120min内每隔15min测定吸光度。结果表明，对照品和样品显色产物在室温下120min内稳定。

2.4.5 回收率试验 取重复性试验同批次三叶青的叶样品0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入近似样品总黄酮含有量的对照品量（芦丁13.5 m g），按2.2项制成供试品溶液，精密吸取4m L，按2.3项显色，测定吸光度并根据标准曲线计算，平行测定6份，结果见表1。

表1 加样回收试验

2.5 样品含量测定 精密称取不同产地三叶青的叶样品各1g，每批测定3份，按2.2项制成供试品溶液，精密吸取4m L，按2.3项显色，以相应的空白显色体系试剂为参比，测定吸光度。同时测定各个批次三叶青叶含水量，按干燥品，计算得不同产地三叶青叶中总黄酮含量，结果见表2。

表2 福建不同产地三叶青叶总黄酮的含量测定

3 讨 论

3.1 采用紫外可见分光光度法测定闽产三叶青的叶中总黄酮含量，该方法经过方法学考察符合分析要求，方法简便、准确，适合于三叶青叶的定量分析和品质评价，为三叶青叶的进一步开发利用提供了实验依据。

3.2 福建不同产地三叶青叶总黄酮含量测定比较表明不同产地其总黄酮含量差异较大，其中以永泰、大田、闽侯、仙游、漳平的含量较高，达到3%以上，相对高于浙江三叶青主产地，提示闽产三叶青中这些产地品质较好，适合开发利用。

［1］《全国中草药汇编》编写组 .全国中草药汇编：上册［M］.北京：人民卫生出版社，1975：31－32.

［2］陈丽芸，郭素华 .三叶青的化学成分及药理作用研究进展［J］.浙江中医药大学学报，2012，36（12）：1368－1370.

［3］丁丽，纪其雄 .三叶青抗肿瘤活性部位的筛选研究［J］.海峡药学，2011，23（12）：46－48.

［4］倪克锋，金波，蒋福升，等 .三叶青黄酮对 H 22荷瘤小鼠T I MP－2 mRNA表达的影响［J］.中国中医药科技，2009，16（3）：195－196.

［5］张立明，樊瑞军，杨凤琴 .三叶青黄酮诱导S MMC－7721肝癌细胞凋亡的实验研究［J］.时珍国医国药，2010，21（11）：2850－2851.

［6］广东省植物研究所 .海南植物志［M］.北京：科学出版社，1974，3－23.

［7］中国科学院中国植物志编辑委员会 .中国植物志：2册［M］.北京：科学出版社，1998：48，122－123.

［8］张宪昌 .台湾药用植物图鉴［M］.台中：晨星出版有限公司，2007：201.

［9］范世明，林婧，许文，等 .不同产地三叶青中总黄酮含量的比较［J］.福建中医药大学学报，2013，23（3）：44－45.

［10］郑军献，胡轶娟，梁卫青，等 .紫外可见分光光度法测定三叶青中总黄酮的含量［J］.中国中医药科技，2009，16（5）：386－387.

［11］蔡韦炜，陈丹，范世明，等 .三叶青地上部分化学成分分析［J］.福建中医药大学学报，2013，23（5）：34－35.