右归饮促异体骨髓细胞向成骨分化防治辐照后骨量丢失机制的实验研究

夏臣杰，尹利明，黄杰烽，陈俊杰，赵 凯，杜文喜

（1.浙江中医药大学第一临床医学院，浙江杭州310053； 2.浙江中医药大学附属第一医院，浙江杭州310053；3.新安国际医院，浙江嘉兴 314031）

骨量丢失是暴露于电离辐射（ionizing radiation，IR）后常见的病理改变［1-3］，严重者可致骨质疏松性骨折，临床多见于转移性骨肿瘤放疗后的患者，给病人带来了巨大的痛苦及沉重的经济负担。骨髓干细胞（bone marrow stem cell，BMSC）是一类具有自我更新和多向分化增殖潜能的原始骨髓细胞，已有研究表明，其在右归饮作用下显著促其向成骨细胞分化［2］。但目前尚缺乏右归饮对骨髓细胞在动物体内分化情况的研究。故本实验设计采用γ辐射破坏杀死骨髓细胞，造成骨量丢失，观察右归饮对回输的同种异体骨髓细胞在小鼠体内向成骨细胞分化的影响，研究其防治辐照后骨量丢失的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物及分组 80只8 w龄SPF级雄性BALB/c小鼠［由上海西普尔-必凯实验室动物有限公司提供；生产许可证号：SCXK（沪）2013-0016］，体重为（20±2）g，随机选32只用于骨髓细胞提取回输，实验组48只。

1.1.2 实验仪器 小动物成像仪（浙江省中医药大学骨伤研究所提供），辐照装置（浙江省农科院提供）。

1.1.3 右归饮制作 称取1倍量处方右归饮51 g（熟地9 g，炒山药6 g，山茱萸3 g；枸杞6 g，炙甘草6 g，姜制杜仲 6 g，肉桂 6 g，制附子 9 g），加适量水浸泡1 h，提取1.5 h/次，提取2次，加10倍水，所得提取液趁热过4层纱布后合并，放冰箱内冷藏12 h后，以4 000 r/min，3℃离心15 min，共2次。合并上清液，加热至沸腾，趁热放置冰箱内冷藏12 h后，再以4 000 r/min，3℃离心15 min，共2次，合并上清液，浓缩到密度为1.35，于60℃减压干燥。干燥物碾细，过120目筛后得到右归饮细粉，加热水化开，4℃冰箱冷藏备用。

1.1.4 骨髓干细胞提取 断颈处死小鼠，投入盛有250 mL左右的75%酒精中浸泡3～5 min，拎出后将小鼠仰面翻铺于超净台上一个消毒托盘上。每只小鼠用2.5 mL PBS溶液冲洗骨髓腔内的细胞，1 200 r/min，离心10 min，去上清，留1 mL。悬浮细胞后加氯化铵溶 液 （NH4Cl：8.99 g/L，KHCO3：1 g/L，EDTA-4Na：0.037 g/L，过滤灭菌，40℃储存）裂解红细胞，按 1∶9比例，即1 mL细胞悬液加进9 mL NH4Cl溶液，混匀，置冰上10 min。1 200 r/min，10 min，去上清。置于4℃冰块盒中，备用。

1.2 实验方法

1.2.1 电离辐射造模 在进行骨髓提取同时，将实验组小鼠随机选8只作为空白对照组。将剩余40只小鼠，分装在8个纸筒内，两端用纱布扎紧，置于无菌的小鼠专用运输盒内，运至浙江省农科院，予以电离辐射，辐射剂量为1 Gy/min，辐射6 min。然后运回浙江中医药大学动物实验中心，随机分成5组，即辐照组、BM回输组、高剂量组、中剂量组、低剂量组，每组8只。

1.2.2 干预措施 空白对照组不予任何处理；辐照组只接受电离辐射；BM回输组在电离辐射基础上，按照1∶1比例，尾静脉回输骨髓细胞；高剂量组、中剂量组、低剂量组在电离辐射和骨髓细胞回输的基础上，分别予以 0.03 mL/g、0.02 mL/g、0.01 mL/g 浓度为0.51 g/mL的右归饮灌胃，每天1次，持续2 w。

1.2.3 血清生化指标检测 2 w后摘除眼球取血，置于离心管中，低温条件4℃下放置4 h后，按照3 000 r/min离心15 min后取上层血清，进行碱性磷酸酶（ALP）检测。

1.2.4 股骨单位体积内骨量（即骨密度）检测 眼球取血后，断颈处死小鼠，整体动物采用小动物成像仪拍摄后测定骨密度。扫描小鼠双侧股骨，保存数据，使用骨密度测定软件分别测定双侧股骨骨密度。

1.2.5 组织学观察 检测完骨量，取双侧股骨上段，剔净软组织，行石蜡包埋、5 μm切片、HE染色，进行组织病理观察。

1.3 统计学方法

用SPSS 19.0进行统计分析，各数据均以均数±标准差（s）表示，计量资料比较用单因素方差分析（one－way ANOVA），以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 双侧股骨骨密度及血清中ALP浓度比较

与辐射组比较，空白对照组、高剂量组、中剂量组骨密度及ALP浓度明显增高（P<0.01，P<0.05）。与BM回输组比较，高剂量组、低剂量组骨密度明显增高（P<0.05），高剂量组ALP浓度明显增高（P<0.05）。与低剂量组比较，高剂量组ALP浓度明显增高（P<0.05）。结果见表1。

表1 小鼠双侧股骨单位体积骨量和血清中ALP浓度比较 （s）

表1 小鼠双侧股骨单位体积骨量和血清中ALP浓度比较 （s）

注：与辐照组比较，1）P<0.01，2）P<0.05；与 BM 回输组比较，3）P<0.05；与低剂量组比较，4）P<0.05

3组别 n 单位体积骨量（g/cm）ALP（pg/mL）辐照组 8 6.01±2.33 1 380.9±180 BM 回输组 8 6.92±1.72 1 594.5±265低剂量组 8 7.00±1.78 1 619.4±207中剂量组 8 8.46±2.012）3）1 827.4±3431）高剂量组 8 9.05±1.711）3）1 886.2±3781）3）4）空白对照组 8 9.16±2.281）1 997.9±2251）

2.2 股骨组织病理学观察结果

辐照组：辐照后骨髓组织结构凌乱，骨髓单核细胞大量消失，部分组织变性，含有大量脂肪空泡，骨小梁稀疏甚至消失；BM回输组：骨小梁较辐照组数量明显增多，骨髓单核细胞数量明显增多，但仍含有大量的变性组织；低剂量组：骨小梁增多增粗，小梁排列紊乱，骨髓单核细胞数量较辐照组明显增多；中剂量组：骨小梁和骨髓细胞情况介于低剂量组和高剂量组之间；高剂量组：骨小梁排列有序坚实，骨髓单核细胞多，变性组织明显减少，接近正常。空白对照组：骨小梁粗壮，排列有序，骨髓细胞数量多。

3 讨论

IR可造成骨量丢失，骨密度下降，严重者可引起骨质疏松性骨折，在宇航员和肿瘤放疗患者身上尤为突出。有临床研究报道，骨盆肿瘤患者放疗后，5年内髋骨和股骨颈骨折发生率增加超过65%［1］，乳腺癌患者接受放疗后肋骨骨折发生率为1.8%［3］，最高可达19%［4］，给患者的身体和心理带来了巨大负担。另外，动物研究发现，小鼠接受2 Gy的电离辐射，117 d予Micro-CT检测股骨和胫骨，骨小梁体积较对照组下降20%，骨小梁间隙增加11%，骨密度下降19%，表明电离辐射可导致小鼠骨量丢失，骨密度下降，脆性骨折发生率增高［5］。目前，IR导致骨量丢失，骨密度下降的机制尚不十分清楚。IR杀死骨髓细胞，包括成骨细胞、间充质干细胞等，抑制成骨细胞的增殖和成骨功能，破坏骨髓内环境，导致成骨形成低下是目前认可的观点［6］。本实验小鼠接受大剂量全身辐照后，破坏杀死骨髓细胞，抑制成骨细胞增殖和成骨功能，引起骨量丢失，导致骨质疏松症。通过检测小鼠双侧股骨骨密度情况，发现γ射线组显著低于空白对照组，表明辐照导致小鼠骨量丢失模型已成功。

BMSC是一类具有自我更新和多向分化增殖潜能的原始骨髓细胞，其组成比较复杂，主要包括间质干细胞、造血干细胞和内皮祖细胞等［7］。其中骨髓间充质干细胞（MSC）易于分离扩增，在不同理化环境和细胞因子的诱导下，可定向地向成骨细胞方向分化，最终形成骨。早在 1995 年，Perira R F 等［8］利用动物实验检测MSC在体内的走向，证实MSC可以向多种造血以外组织迁移定位并分化为相应的组织细胞，成功地向成骨细胞分化。国内学者韩冬等［9］在体外矿化诱导兔MSC，将诱导后MSC-去抗原牛松质骨复合体植入裸鼠背部皮下。结果表明MSC向成骨细胞方向分化和增殖。大量实验研究表明，骨髓间充干细胞的成骨分化功能，使其在治疗骨量丢失、骨质疏松症、骨折延迟愈合、骨折不愈合等疾病中具有巨大的潜力。随着细胞工程学的发展，体外诱导MSC向成骨细胞分化也越来越成熟。在含有胎牛血清的低糖DMEM中加入地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C或碱性成纤维生长因子（b-FGF）和骨形态发生蛋白可以诱导MSC向成骨细胞分化。

对于成骨细胞的鉴别可以依靠成骨细胞的特异性分泌蛋白，如ALP、骨钙素（OPG）和I型胶原蛋白等，以及体外矿化的功能特征。碱性磷酸酶活性被认为是成骨细胞的一个重要生物学标志。文献报道，血清ALP与骨形成参数间为正相关关系，可作为监测和初步判断成骨细胞活性的简易指标之一［10］。在成骨细胞增殖晚期，分泌ALP与钙盐结晶体至细胞外基质中，ALP可使局部磷酸含量增高，促使基质矿化，能够反映成骨细胞合成I型胶原、形成骨基质的能力［11］。因ALP是一种细胞外酶，可释放到血液循环中，故可用来监测体内成骨细胞的增殖和活动情况。

右归饮出自明代张介宾的《景岳全书》，作为温补肾阳的代表方剂，《医经精义》云“肾藏精，精生髓，髓生骨，故骨强”。说明骨为髓所主，骨的生长发育有赖于髓的濡养。若肾气不足，肾精亏虚，骨髓失充，骨骼失养，则脆弱乏力。右归饮具有温补肾阳、益骨生髓的功效。在细胞研究中发现右归饮具有促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化、增殖，提高成骨细胞活性的作用。吴云刚等［2］将右归饮含药血清加入骨髓基质干细胞诱导分化成骨细胞的体外实验研究中发现，右归饮能促进骨髓基质干细胞向成骨细胞分化。

辐照可以破坏杀死骨髓细胞，造成小鼠股骨骨密度下降，骨量丢失。经过BM回输，右归饮灌胃治疗后，小鼠双侧股骨骨密度较辐照组和BM回输组显著增加，血清ALP浓度升高，股骨组织病理发现骨小梁排列有序且坚实，骨髓单核细胞数量多，变性组织少，显著优于辐照组。综上所述，右归饮可促进异体骨髓细胞向成骨细胞分化，改善辐照后骨量丢失情况。

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