益气活血方对冠心病心气虚大鼠模型心肌细胞凋亡的影响

孔春明，邱丽芬，张红梅，马月香

（1.山东中医药大学，山东济南250014； 2.济南市历下区人民医院，山东 济南250355）

冠心病（coronary artery heart disease，CHD）是临床常见病、多发病，其发病率有逐年递增的趋势。中医学中没有“冠心病”病名，依据其临床表现，辨证多属于“胸痹”“心痛”等范畴，中医在CHD的治疗方面发挥着独到的优势。研究表明在冠心病所有的中医辨证分型中以气虚型所占比例最多［1-2］。对于“气”在冠心病发病中的重要作用的认识古已有之。如清代魏荔彤提倡胸痹的病机为“气血凝滞”说，论述曰：“胸痹者，痹于胸也。痹病，风挟寒湿之邪客于分肉，本在躯壳之表，何有痹于胸者？……唯阳气虚极，斯气血凝聚，迟缓胶固，所以至于胸痹而心亦痛也。”（《金匮要略本义》）明代汪机对于本病病因的论述曰：“未有不由气滞而致者，古方皆用行气散气之剂，治而愈之。”（《医学原理》）因此对于冠心病心气虚的研究具有重要的意义。本研究通过对冠心病心气虚大鼠模型进行益气活血方药的干预治疗，观察各组大鼠心肌细胞凋亡的形态学改变，以探讨益气活血方药对冠心病心气虚大鼠模型心肌细胞凋亡的影响，为中药治疗冠心病心气虚证提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 Wistar雄性大鼠，体重（200±20）g，北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2012-0001。

1.1.2 实验中药 人参、黄芪、丹参、川芎中药饮片，均由山东中医药大学附属医院提供。

1.1.3 试剂与仪器 石蜡切片机（德国，Leica）、石蜡包埋机（德国，Leica）、光学显微镜（日本，Olympus）、苏木素伊红（HE）染色试剂盒（产品编号C0105，碧云天生物技术公司提供）、小动物呼吸机（河北医科大学仪器厂）、手术包（山东中医药大学附属医院）；左旋硝基精氨酸（L-NNA，Sigma公司）、盐酸地尔硫（天津田边制药有限公司）。

1.2 实验方法

Wistar雄性大鼠随机分为空白组、模型组、假手术组、西药组，益气活血方低、中、高剂量组，每组10只。大鼠经10%水合氯醛250 mg/kg腹腔注射麻醉。无菌条件下气管切开、插管、上动物呼吸机正压辅助呼吸。胸部去毛，消毒，沿左锁骨中线纵行切开皮肤2 cm，在第四或五肋间钝性分离肌层，打开胸腔，剪开心包，轻压右侧胸廓，快速挤出心脏，在左冠状动脉前降支中上1/3处行结扎后把心脏放回胸腔。逐层关胸，待动物苏醒后拔气管插管。24 h后以心电图ST段下移和T波改变为标准判断其为CHD大鼠模型。术后每只大鼠每天肌注青霉素10万U预防感染。术后大鼠于常规喂养1 w后，空白组和假手术组给予生理盐水1 mL，腹腔注射4 w。其余各组以15 mg/（kg·d）左旋硝基精氨酸分2次腹腔注射4 w［3］。造模成功后益气活血方低、中、高剂量组分别灌服低、中、高不同浓度梯度的益气活血中药煎剂1.6 mL/100 g；西药组每日按体重以30 mg/kg灌服盐酸地尔硫 混悬液1.6 mL/100 g；空白组、假手术组、模型组以1.6 mL/100 g灌服生理盐水。

1.3 心肌细胞凋亡检测

45 d后进行麻醉，取心肌组织，HE染色检测结扎处心肌细胞形态学变化。取心肌组织进行固定并按常规方法进行石蜡包埋、切片，按照苏木素伊红（HE）染色试剂盒说明进行组织染色，观察结扎处心肌细胞形态学改变。

2 结 果

空白组大鼠心肌细胞排列整齐，轮廓清晰，细胞核完整，胞质均匀；假手术组心肌细胞排列较为整齐，见少量肌细胞呈波浪状改变，细胞间隙均匀，少量炎性细胞浸润；模型组心肌细胞排列紊乱，细胞坏死，较多炎性细胞浸润，细胞核固缩变形甚至脱失，血管管腔增大，组织间隙明显增宽并充填有大量纤维组织，横纹模糊断裂；西药组、益气活血方低剂量组、益气活血方中剂量组心肌细胞变性、坏死程度较模型组有改善，血管扩张程度减轻，少量炎性细胞浸润；益气活血方高剂量组心肌细胞排列较为整齐，未见明显炎性细胞浸润，无明显血管扩张，纤维增生程度较模型组减轻明显。结果见图1~图7。

3 讨 论

图1 空白组心肌组织病理特征

图2 假手术组心肌组织病理特征

图3 模型组心肌组织病理特征

图4 西药组心肌组织病理特征

图5 低剂量组心肌组织病理特征

图6 中剂量组心肌组织病理特征

图7 高剂量组心肌组织病理特征

有研究表明，心肌细胞的凋亡不仅与心肌重塑有关，而且会促进心力衰竭的发生和发展及恶化，这可能与心肌细胞的缺失有关。心肌细胞的凋亡及数量的减少会导致心肌收缩力的降低，进而影响心功能［4］。有研究表明，冠心病心气虚证与心功能的降低关系密切［5-8］。本研究发现，模型组心肌组织坏死严重而益气活血方高剂量组可以改善心肌组织的坏死程度，进而改善心功能，进一步表明对心功能的评价与判断可以作为冠心病心气虚的诊断依据。

本实验发现模型组心肌细胞排列紊乱，细胞坏死，较多炎性细胞浸润，细胞核固缩变形甚至脱失，血管管腔增大，组织间隙明显增宽并充填有大量纤维组织，横纹模糊断裂。本课题前期临床研究发现冠心病心气虚患者普遍存在血浆儿茶酚胺类物质的升高改变。而且有学者将60例CHD患者分为40例心气虚证和20例非心气虚证，检测血浆（E、NE），结果显示心气虚证患者血浆中NE、E均升高，与非心气虚证组及正常组比较差异显著（P<0.01）［9］。CHD 心气虚证患者血浆中儿茶酚胺明显升高，说明冠心病心气虚心肌细胞的凋亡与儿茶酚胺类物质的变化关系密切，而益气活血方高剂量组能够抑制并扭转心肌细胞的凋亡，而减轻心肌缺血缺氧导致的细胞损伤，说明中药益气活血方可能是通过改变血浆儿茶酚胺类物质的含量从而起到改善心功能的作用。我们前期研究发现Gs-AC-cAMP-PKA信号通路介导的RyR2开放异常，可以引起心肌收缩力的降低。开放异常是由于当儿茶酚胺类物质含量升高时，使β-肾上腺素受体被持续激活，导致PKA过量产生，心肌细胞内RyR2被过度磷酸化，导致RyR2通道功能性关闭不全，造成RyR2通道的舒张期钙渗漏，继而肌浆网内钙库内的钙离子量减少，影响收缩期细胞内的Ca2+浓度，进而导致心肌细胞内用于心肌兴奋收缩耦联所需的Ca2+减少，心肌收缩力降低，发生心功能减退。由此我们可以推测Gs-AC-cAMP-PKA信号通路介导的RyR2开放异常很可能是引起心肌细胞凋亡的原因，具体作用机制有待于实验的进一步论证。

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