安胎丸小鼠骨髓细胞染色体畸变试验

冯杰++侯连莉++陆土柳++于志瀛

摘 要：目的：通过检测安胎丸对体细胞的致突变性，对其遗传危害性做出初步评价。本研究选用7个厂家的12批次安胎丸样品进行了小鼠骨髓细胞染色体畸变实验[1]的研究。方法：选用雌性NIH小鼠，按4mg/kg体重的剂量连续灌胃4天给予安胎丸，镜检股骨骨髓。 结果：表明全部样品的平均畸变率均明显低于阳性对照组的平均畸变率，全部样品的平均畸变率与阴性对照组的平均畸变率基本相当。结论：本研究的全部安胎丸样品对小鼠骨髓细胞染色体均无致畸变性。

关键词：安胎丸；骨髓细胞；染色体畸变；遗传毒性；致突变

中图分类号：R273 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2017）12-0197-02

安胎丸是一种养血安胎的中成药，由当归[2]、白芍、川芎、菟丝子、川贝母、黄芪[2]、荆芥、厚朴、艾叶、积壳、羌活、甘草组成。用于妊娠血虚，胎动不安，面色淡黄，不思饮食，神疲乏力等症。现代多用于先兆性流产，妊娠贫血等[3-4]。由于胎儿细胞分裂、分化发育等非常旺盛，对孕妇用药的遗传毒性有更高的要求。据相关报道称，在遗传毒性试验中出现阳性结果的中药较少，即使有一定的遗传毒性，也大都是在远远高出人们正常服用的剂量下出现的，小剂量并不足以引起危险[5]，以致人们对其安全性的忽略。目前对安胎丸的应用相对广泛，而对其安全性评价相对较少。安胎丸，作为一种孕妇常用中药，对其遗传毒性的评价有较大意义。本文通过小鼠骨髓细胞染色体畸变试验，为其安全性毒理学评价提供依据。

本研究用哺乳动物骨髓细胞染色体畸变的方法，对收集到的部分安胎丸样品（7个厂家的12个批次）的致突变性进行了安全性评价（见表1）。虽然不同的厂家安胎丸的配方基本相同，但所用原材料来源与质量、炮制工艺等可能会有差别，因此我们将收集的样品的全部厂家都列入考察范围。而每个厂家的不同批号间相对稳定性较高，结合工作量进行考虑，本次研究每个厂家选用1-2个批号进行检查。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验样品

安胎丸，规格：每丸重6g。本品为棕色的大蜜丸。人体推荐用量为每日2次，一次1丸，1日12g，按60kg体重这算成0.2g/kg。

1.1.2 实验动物

选用NIH小鼠，每组5只，雌雄各半，逐一称重，体重为20g-22g，动物室温温度：22℃～25℃，相对湿度：55%～70%。

1.1.3 主要仪器与试剂

仪器：实验室常用仪器、解剖器械、离心机、恒温水浴箱37±5℃、载玻片、生物显微镜。

试剂：0.1%秋水仙素、环磷酰胺、2.2%柠檬酸钠、90%NaCl溶液、甲醇：冰醋酸3：1（现配现用）、0.75mol/L KCl溶液、Giemsa应用液（取1mlGiemsa原液，加入KH2PO4溶液3.6ml，KH2PO4·H2O溶液5.4ml）。

Giemsa原液配制：称取Giemsa染料1.0g于研钵中，加甘油44ml，研磨至无颗粒，56℃水浴保温2h，取出加入66ml甲醇，混匀，滤纸过滤，保存于棕色瓶中备用。

KH2PO4溶液：称取KH2PO4粉0.908g，加超纯水100ml溶解。

KH2PO4·H2O溶液：称取KH2PO4·H2O粉1.187g，加超纯水100ml溶解。

1.2 动物分组与剂量设置

在前期预实验的基础上，参照《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版），选用20g/kg BW的一个剂量组，每天灌胃1次，连续灌胃4天，在末次给受试物后24h取材。处死动物前3h，按4mg/kg BW腹腔注入秋水仙素。另外，设阳性对照和阴性对照，阳性对照选用40mg/kg BW腹腔注射环磷酰胺，阴性对照用同体积的纯化水，给药频率和给药方式与样品相同。

1.3 试验方法

（1）用二氧化碳麻醉法处死动物，解剖取出股骨，剔除肌肉等组织。（2）剪去两端骨骺，用注射器吸取4mL 2.2%柠檬酸钠从股骨一端冲洗，用10ml离心管收集骨髓细胞悬液。（3）将细胞悬液置于离心机以1500rpm离心10min，弃去上清液，沉淀加4ml 0.075mol/L KCl溶液，用滴管轻吹混匀，置37℃水浴箱低渗处理30min。（4）加入2ml固定液（甲醇：冰醋酸=3：1），轻轻摇匀，37℃水浴放置10min，然后以1500rpm离心10min，弃去上清液。（5）再加入5ml固定液，轻轻吹打混匀，37℃水浴放置20min，1500rpm离心10min，除去上清液。（6）加入5ml固定液，轻轻吹打混匀，37℃水浴放置20min，1500rpm离心10，min，除去上清液，留约0.5ml固定液，轻轻吹打混匀。（7）从-30℃冰箱中取出冰冻的载玻片，悬空约（50cm）滴片，自然干燥。玻片编号，倒扣于片架。（8）用配制好的Giemsa应用液加满片架凹槽，染色15min，后用清水冲洗干净，晾干，存放于片盒中，以便观察。

1.4 显微镜观察

在低倍镜下，每组各选择100个左右分散良好，细胞末破裂的中期分裂相細胞，在显微镜油镜下读片进行染色体畸变分析，在读片时记录每一观察细胞的染色体数目，记录染色体畸变细胞在显微镜视野的坐标位置及畸变类型（染色体结构异常：断裂、微小体、有着丝点环、无着丝点环、单体互换、双微小体、裂隙、粉碎化。染色体数目异常细胞：多倍体；非整倍体性畸变；内复制。）

1.5 统计学方法

用χ2检验对试验数据进行统计学处理，观察各试验组畸变细胞率与阴性对照组和阳性对照组比较差异是否有统计学意义。

2 实验结果与结论

2.1 结果

由表2可见，全部样品和全部厂家的平均畸变率均明显低于阳性对照组的平均畸变率（卡方检验均有显著性差异，p<0.01），全部样品和全部厂家的平均畸变率与阴性对照组的平均畸变率基本相当（卡方检验均无显著性差异）。表明本研究的全部样品均无明显的致畸变性。厂家之间及相同厂家不同批次之间的平均畸变率虽然小有不同，但无统计学差异，推测为动物个体差异造成。

2.2 结论

本次实验结果表明，广西梧州三鹤药业有限公司等7个厂家12批次的安胎丸对小鼠骨髓细胞的染色体均无致畸变性。

3 讨论

染色体异常也称染色体发育不全，指的是染色体的数目异常和结构畸变。智力低下和生长发育迟滞是染色体病的共同特征。药物对人类的生殖危害是深远的，它不仅对畸形儿本身的生理、心理造成障碍，对患儿家庭乃至整个社会都是沉重的负担，因而，只要有可能造成人類畸形的药物都需引起人们的高度重视，以确保妇女用药安全[5、6]。

骨髓细胞染色体畸变分析试验观察的是分裂间期与前期的细胞染色体畸变，与骨髓微核试验不同，能够直接反应骨髓细胞染色体畸变发生率的高低，从而判断受试物是否具有突变作用[7、8]。在本实验对7个厂家12批次的安胎丸进行安全性评价中，无小鼠死亡，未出现致突变作用，表明安胎丸对哺乳动物染色体可能不具有损伤效应。另外，目前国内已有不少临床报道证实安胎丸在治疗先兆流产方面有显著疗效。安胎丸不仅可以用于治疗先兆流产，也能用于预防流产的发生，服用方便，值得临床推广使用

参考文献

[1]孟紫强，张波.二氧化硫吸入诱发小鼠骨髓细胞染色体畸变的效应[J].中华预防医学杂志，2002，36（4）：229.

[2]张春颖，周钟鸣.常见中成药的致突变性研究进展[J].中国中医药信息杂志.2001，8（3）：20.

[3]王芳，刘晓杭.固肾安胎丸治疗早期先兆流产临床疗效观察[J].中国医院用药评价与分析.2011，11（12）：1121-1123.

[4]刘红梅，张鹏，秦红，刘寨华.固肾安胎丸治疗肾虚型早期先兆流产的临床研究[J].中国中医基础医学杂志，2011，17（10）：1164-1165.

[5]孙于兰.三七、白术、巴戟天的遗传毒性研究[D].四川大学.营养与食品卫生学，2003.

[6]刘世清，熊文，杜予民，丁万军.羧甲基壳聚糖的骨髓细胞染色体畸变试验[J].毒理学杂志，2008，22（1）：70-71.

[7]赵刚，张寅静，郭小娟.健脾生血颗粒遗传毒性研究[J].世界中医药.2016，12（11）：2760-2763.

[8]张盼红，刘志永，王鸿.四乙酰基六氮杂异伍兹烷致小鼠骨髓细胞突变性的实验研究[J].工业卫生与职业病，2017，2（43）：93-95.