河南洛阳地区流产奶牛感染性病原的分子检测

翟 凯，钱伟锋，王天奇，邵晓冬，闫文朝，韩利方，吕超超

（1.河南科技大学动物科技学院，河南 洛阳 471003；2.普莱柯生物工程股份有限公司，河南 洛阳 471000）

河南洛阳地区流产奶牛感染性病原的分子检测

翟 凯1，钱伟锋1，王天奇1，邵晓冬1，闫文朝1，韩利方1，吕超超2

（1.河南科技大学动物科技学院，河南 洛阳 471003；2.普莱柯生物工程股份有限公司，河南 洛阳 471000）

为调查洛阳地区引起奶牛流产的主要病原，于2013年7月至2014年3月，收集该地区6个奶牛场（或小区）共42头新鲜流产胎牛，及其母体的血液、阴道分泌物和鼻腔分泌物，计为42例样本，采用PCR或RT-PCR方法对所采集样本进行新孢子虫、弓形虫、胎儿三毛滴虫、布鲁菌、牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）和牛病毒性腹泻病毒（BVDV）6种常见流产病原的核酸检测。结果显示，被检样本总感染率为42.9%（18/42），其中新孢子虫感染率最高，为40.5%（17/42）；IBRV次之，为11.9%（5/42）；胎儿三毛滴虫、布鲁菌、弓形虫和BVDV感染率分别为2.4%、2.4%、2.4%和0。14.3%（6/42）的被检样本存在混合感染，其中以新孢子虫+IBRV混合感染为主（50%，3/6）。结合被检流产奶牛的临床特征及饲养管理等因素，推断新孢子虫是导致该地区奶牛流产的最主要病原，本研究结果将为该地区有效防控奶牛流产提供科学依据。

奶牛；流产；病原；PCR；新孢子虫

奶牛流产导致产犊间隔扩大，增加养牛的饲料成本，影响高产奶量的获得和后备牛的扩充，给奶牛养殖业造成了严重的经济损失。据统计，每个流产病例平均经济损失达640美元[1-2]。一般认为，牛场的年流产率在3%～5%为正常现象，但据近年调查显示，国内奶牛流产率达10%～25%[1-3]。诊断分析流产原因，对预防和控制奶牛流产具有重要的意义。

引起妊娠母牛流产的原因可分为病原性因素和非病原性因素。国内外研究发现，病原性因素引起的奶牛流产最多达90%左右[2]，其中最常见

的相关病原有新孢子虫（Neospora caninum）、弓形虫（Toxoplasma gondii）、胎儿三毛滴虫（Tritricho⁃monas foetus）、布鲁菌（Brucella abortus）、牛传染性鼻气管炎病毒（infectiousbovine rhinotracheitisvirus，IBRV）、牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea vi⁃rus，BVDV）等[1-2，4-5]。本实验室于2013年7月对洛阳地区部分奶牛养殖场（小区）就奶牛流产情况进行了调查，奶牛流产率均在10%以上，个别养殖户的奶牛流产率高达20%，但引起流产的原因尚不清楚。为调查洛阳地区引起奶牛流产的主要病原，本研究从该地区奶牛场（小区）采集流产胎牛及其母体的血液、鼻腔分泌物和阴道分泌物，通过PCR或RT-PCR方法检测可能引起奶牛流产的6种病原，结合流产奶牛的临床表现、养殖场饲养管理等方面因素，分析引起奶牛流产的主要病原，为该地区奶牛流产的科学防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集 于2013年7月至2014年3月期间，采集洛阳地区6个奶牛养殖小区42头新鲜流产胎牛，及其对应母体的血液、鼻腔分泌物和阴道分泌物，计为42份样本。36个流产病例为妊娠5～7个月流产，流产母牛均未见其他明显的临床症状；其余6例为妊娠5个月内流产。

所采集流产胎牛的心、脑组织用于新孢子虫（N.caninum）和弓形虫（T.gondii）的检测，肝、脾、肺、肾用于IBRV、BVDV和布鲁菌（B.abortus）的检测，肺和皱胃内容物用于胎儿三毛滴虫（T.foetus）的检测；母体鼻腔分泌物用于IBRV的检测，阴道分泌物用于胎儿三毛滴虫（T.foetus）、布鲁菌（B. abortus）和BVDV的检测；全血用于除胎儿三毛滴虫外上述5种病原的检测。

1.2 主要试剂 组织/血液/细胞DNA提取试剂盒为北京庄盟国际生物基因科技有限公司产品；RNA提取试剂盒为天根生化科技（北京）有限公司产品；反转录试剂、2×Easy Taq PCR SuperMix、DNA Marker DL-2 000、pEASY-T1 Simple克隆载体、DH5α感受态细胞、DNA凝胶回收纯化试剂盒等为北京全式金生物技术有限公司产品。

1.3 核酸提取和反转录 待测样本的DNA和RNA提取、RNA的反转录分别参照试剂盒说明书进行。

1.4 PCR检测 弓形虫的巢氏PCR扩增引物及反应条件参考ContiniC.等[6]的报道；新孢子虫、胎儿三毛滴虫、IBRV、BVDV和布鲁菌的PCR扩增引物及程序参考Yang N.等[4]的报道。PCR扩增所针对的6种病原基因、目标片段大小及引物序列见表1。随机选取部分PCR阳性产物，与pEASYT1 Simple克隆载体连接，转化至DH5α感受态细胞中，经蓝白斑筛选并鉴定后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

2 结果与分析

2.1 6种病原的PCR扩增情况 除BVDV外，其余5种病原均有检出（图1～图5）。测序及序列比对结果显示，扩增的布鲁菌16sRNA基因、IBRV gB基因、弓形虫B1基因和胎儿三毛滴虫rRNA基因的序列分别与GeneBank中相应病原序列（KC790986、

KF734618、HC607827和KJ439572）的核苷酸相似性均为100%。测得的3株新孢子虫Nc5基因序列之间有4个碱基存在差异，相似性为99%。与GenBank中北京株新孢子虫（JN106449、JN106453、JN106452）和国外报道的新孢子虫序列（EU073600、AY911515、AY665722）的相似性为98%～99%。

表1 6种病原扩增的引物

图1 流产胎牛脑和心脏中新孢子虫Nc5基因的巢氏PCR扩增产物M：DNA分子质量标准；A1、A2：1头流产胎牛的脑、心；B1、B2：另1头流产胎牛的脑、心；+：阳性对照，-：阴性对照

图2 1头流产胎牛的肺、肝、脾、肾中IBRV gB基因PCR扩增产物M：DNA分子质量标准；1～4：流产胎牛的肺、肝、脾、肾；+：阳性对照；-：阴性对照

2.2 流产病例6种病原的检出情况 42例样本中有18例（42.9%）被检出至少一种病原（表1）。其中，新孢子虫感染率最高，为40.5%；其次为IBRV，为11.9%；胎儿三毛滴虫、弓形虫和布鲁菌感染率均为2.4%，未检出BVDV。同时感染2种或2种以上病原的样本有6例，占被检样本总数的14.3%（6/42）。其中，新孢子虫＋IBRV 3例，新孢子虫＋胎儿三毛滴虫、新孢子虫＋弓形虫、新孢子虫＋布鲁菌＋IBRV各1例。

图3 流产胎牛肺组织中胎儿三毛滴虫rRNA基因PCR扩增产物M：DNA分子质量标准；1～4：4头流产胎牛的肺；+：阳性对照；-：阴性对照

图4 流产胎牛肺、肝、脾、肾中布鲁菌16S rRNA基因的PCR扩增产物M：DNA分子质量标准；1～4：流产胎牛的肺、肝、脾、肾；+：阳性对照，-：阴性对照

图5 流产母牛血液中弓形虫B1基因的巢氏PCR扩增产物M：DNA分子质量标准；1～6：6头流产奶牛的血液；+：阳性对照；-：阴性对照

2.3 不同类型样品的检出情况 17头新孢子虫阳性的流产胎牛，有9例在其母体血液中检出。5例IBRV阳性的流产胎牛，有2例在其母体的血液和鼻腔分泌物检出，有1例仅在其母体的鼻腔分泌物中检出。弓形虫阳性病例仅见于1头流产母牛，而在

其流产胎牛组织中未检出，经间接血凝试验（IHA）检测，该流产母牛血清中存在弓形虫抗体，但抗体水平较低（1∶64）。布鲁菌阳性的流产病例在其流产胎牛及其母体阴道分泌物中均被检出，胎儿三毛滴虫仅在1头流产胎牛肺内被检出。

表2 流产奶牛42例样本中6种病原的PCR检测结果

3 讨论

导致奶牛流产的原因极其复杂，除非病原因素外，有约30多种病原可引起奶牛的流产。流产奶牛通常无典型的示病性临床症状，也难以通过流产胎儿组织的病理变化确定病因。常规实验室诊断技术如病原分离培养、病理组织学检查等技术，耗时耗力且灵敏度较低。PCR方法特异性强，敏感性高，且具有快速诊断的优点，可弥补以上诊断方法的不足[7]。

本研究以引起奶牛流产的6种常见病原为检测对象，结果检出5种病原。其中新孢子虫的阳性率最高，IBRV次之，布鲁菌、弓形虫、胎儿三毛滴虫检出率相对较低，表明新孢子虫可能是引起洛阳地区奶牛流产的主要病原因素。Yang N.等[4]于2012年对北京地区流产胎牛进行9种病原的PCR检测，结果IBRV和新孢子虫的检出率较高，分别是36.3%（29/ 80）和31.3%（25/80），而其他病原检出率较低，与本调查检测结果相似。然而，不同地区致奶牛流产的病原可能不同，如操国景等[2]2011年报道，北京某奶牛场新孢子虫和牛病毒性腹泻病毒抗体阳性率分别为83%和75%，二者是主要病原因素，而布鲁菌、李氏杆菌和牛传染性鼻气管炎病毒抗体均为阴性；王双山[1]等2013年报道，河南安阳某规模化奶牛场流产奶牛布鲁菌、弓形虫、新孢子虫、衣原体抗体阳性率分别为28%、10%、8%和0，前3种病原可能是导致奶牛流产的主要致病因素。国内关于流产奶牛感染胎儿三毛滴虫的报道较少，Yang N.等[4]2012年报道，北京地区奶牛流产胎儿肺中胎儿三毛滴虫的PCR检出率为5%（4/80），在其中1头流产母牛的阴道分泌物中检出，高于本调查的检出率（2.4%）。不同地区致奶牛流产的病原因素的差异性可能与区域内奶牛引种来源、饲养管理方式等方面有关。

本研究结果显示，流产胎牛新孢子虫的检出率高达40.5%（18/28），低于北京地区Yao L.等[8]2009年的报道（57.7%），但高于Yang N.等[4]2012年的报道（31.3%）。在18例被检出流产相关病原的样本中，有17例为新孢子虫阳性。通过临床调查得知，这17例新孢子虫阳性的奶牛均在妊娠5～7个月出现流产，且未见其他明显的临床表现，与KiowaiM.等[9]报道的新孢子虫阳性牛的平均流产时间为妊娠5～7个月相符。洛阳地区奶牛养殖多以小区形式存在，一个小区内有多家养殖户，每户有单独的牛舍、活动场和饲料库。它们除共用一个通道进入挤奶房外，引种、饲养管理、疫病诊断及防制等均各自独立。同时，这些奶牛养殖小区内均有犬存在，犬在夜间均被放开自由活动，可自由进入牛舍、活动区和饲草存放区，其粪便中的卵囊可能会污染饲草及饮水。且多数畜主会把胎盘和流产的胎牛直接喂犬，从而使新孢子虫在犬与奶牛之间循环传播，这可能是流产胎牛新孢子虫检出率高的原因。根据Dubey JP.等[10]提出的奶牛感染新孢子虫的风险因素，如牛场内犬的存在、饲草饮水污染和缺乏管理等，可以推断新孢子虫是造成该地区奶牛流产的主要病原。

IBRV的检出率为11.9%（5/42），总体阳性率低于Yang N.等[4]2012年报道的北京地区流产胎牛36.3%的检出率，亦低于石冬梅等[11]报道的河南省牛IBRV 59.29%的平均血清阳性率。结果虽然表明IBRV在洛阳地区流产奶牛相关病例中存在，但本研究所检测的流产奶牛均未见厌食、发热、咳嗽、呼吸加快和结膜炎等IBR特征性临床症状，且在5头IBRV阳性病例中，有4头的流产胎牛混合感染新孢子虫或布鲁菌＋新孢子虫，因此，IBRV可能不是该地区引起奶牛流产的主要病原。

本试验通过对洛阳地区部分奶牛场（小区）的流产样本进行6种常见病原的PCR检测，结合流产奶牛的临床特征、饲养管理等因素综合分析，推断新孢子虫是引起该地区奶牛流产的主要病原。研究结果将为今后该地区奶牛流产的防控提供科学依据。

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M olecule Detection of Infectious Pathogens in Abortion Dairy Cattle in Luoyang

ZHAIKai1，QIANWei-feng1，WANG Tian-qi1，SHAO Xiao-dong1，YANWen-chao1，HAN Li-fang1，LV Chao-chao2
（1.College of Animal Science and Technology，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China；2.PuLike Biological Engineering Co.，Ltd，Luoyang 471000，China）

In order to investigate themain cause of abortions in dairy herds in Luoyang，a total of 42 clinical abortion cases in⁃cluding 42 fresh aborted fetuses and samples（blood，nasal secretions，and vaginal secretions）from the corresponding aborting dams in 6 dairy herdswere collected between July 2013 and March 2014.Six infectious pathogens Neospora caninum，Toxoplasma gon⁃dii，Tritrixhomonas foetus，Brucella abortus，infectious bovine rhinotracheitis virus（IBRV），and bovine viral diarrhea virus（BVDV）were exam ined by PCR or RT-PCR.Results from this study indicated that the total infection rate was 42.9%（18/42）.Ofwhich the infection rate of N.caninum was the highest（17/42，40.5%），followed by the rate of IBRV（5/42，11.9%）.The infection rates of T. foetus，B.abortus，T.gondii and BVDV were 2.4%，2.4%，2.4%and 0，respectively.Themixed infection ratewas 14.3%（6/42），of whichmixed infection by N.caninum and IBRV was common（3/6，50%）.Combined with the clinicalmanifestations of the aborting cows and management in these dairy herds，N.caninum was thought to be themost potential cause of abortions in dairy herds in Luoyang.This studywillprovide scientific basis for effective prevention and controlof abortion agents in dairy cows in the region.

dairy cow；abortion；pathogens；PCR；Neospora caninum

s：QIANWei-feng；WANG Tian-qi

S852.72+3

A

0529-6005（2015）11-0016-04

2014-08-25

河南科技大学博士科研启动基金

翟凯（1989-），男，硕士生，研究方向为兽医寄生虫学，E-mail：1528562000@qq.com

钱伟锋，E-mail：qw f2012@yeah.net；王天奇，E-mail：wtq@mail.haust.edu.cn