猕猴源毛滴虫的鉴定

蒙笑

摘要：本研究以18个 SrRNA和5.8个 SrRNA基因为基础，对引起猕猴腹泻的肠内毛滴虫病进行形态学观察，并对其进行了病理切片、碘液染色。通过对三毛滴虫18 SrRNA、五毛滴虫5.8 SrRNA的序列进行 PCR分析，对其进行了序列比较，并建立了演化树。形态学分析表明，毛滴虫为梨形或接近卵形，2～5条营养体前鞭毛和1条后鞭毛；三毛滴虫18 SrRNA、五毛滴虫5.8个 SrRNA序列的 PCR分析只得到18个 SrRNA，而18个 SrRNA的测序与 GenBank公司公布的三毛滴虫胚胎序列有97.2%的相似性。通过对猴源毛滴虫的形态学和分子生物学的研究，证实其为猕猴源三毛滴虫，该研究为猕猴肠内寄生虫的鉴别和检测提供了依据。

关键词：猕猴；三毛滴虫；形态观察；18SrＲNA序列；基因分析

0 引言

猕猴是一种重要的非人类灵长目，是研究人体健康与疾病的理想动物，在普通环境下饲养的猕猴，会被寄生体感染，寄生虫感染对猕猴的健康和对试验结果的影响很大。三毛滴虫是一种寄生在动物的肠道内的寄生虫，造成动物的反复拉肚子，对身体的养分吸收有很大的影响，严重地威胁到了它们的生命，严重威胁到了猕猴的养殖。迄今为止，关于三毛滴虫属的形态学、分子生物学等已在猪、猫等物种中进行了大量的研究，但关于其形态及分子特征的研究却很少。本文以猕猴肠道毛滴虫体为研究对象，利用18 SrRNA基因序列，对毛滴虫进行了精确的鉴别，为毛滴虫病的临床诊断提供了依据。

1 病原毛滴虫的分类及其形态特征

毛滴虫属于原虫门、鞭毛虫纲、动鞭毛纲、毛滴虫目、毛滴虫科、毛滴虫属、三毛滴虫属[1]。

1.1 寄生于人的毛滴虫

已知四种可寄生于人体的毛滴虫，即人五毛滴虫、弱双核阿米巴、口腔毛滴虫、阴道毛滴虫，主要为阴道毛滴虫。人五毛滴虫是一种寄生在人类和哺乳类动物的肠道中的寄生虫，具有卵形的细胞核和1个副基器，具有4条前鞭毛、1条独立的前鞭毛、1条后鞭毛，后鞭毛从波动膜的左边一直到虫体的末端脱离波动膜，并在体外游离。软质双核阿米巴是阿米巴型的鞭毛虫，寄生在人体的结肠黏膜上，没有包囊，只在滋养体期；直径7～12µm，长有假足，宽而透明，尖端有分支；由于其结构及抗原特征都属鞭毛虫，因此将其归入毛滴虫科。口腔毛滴虫寄生在牙垢和龋洞中，前鞭毛4条，后鞭毛没有游离端，仅有一个核，在虫体前方；柱状结构细长，沿着昆虫的尾端延伸。

1.2 寄生于动物的毛滴虫

1.2.1 寄生于猪的毛滴虫

可感染猪的毛滴虫有多种分类方法，可以为临床诊断和治疗提供重要依据，因此，应用形态学和分子生物学的方法进行分类分析更具有科学性。利用三毛滴虫体18 SrRNA和5毛滴虫5.8 SrRNA的形态学分析，对毛滴虫进行了初步的分析，结果表明，三毛滴虫体与犬胚胎具有97.2%的相似度。研究发现，在猕猴体内的毛滴虫为三毛滴虫，在标本中未发现三毛滴虫和五毛滴虫的杂交，为猕猴体内肠道寄生虫病的诊断和治疗提供依据[2]。

巴特里四毛滴虫是一种常见的寄生虫，主要分布在盲肠、结肠，有时在小肠内，其体形较圆三毛滴虫、猪三毛滴虫为卵形；动作迅速，方向不定，常做环形动作，形体变化较大；前部有3～4条不同长度的鞭毛，从尾端向后伸展，呈3～5条波纹。三毛滴虫以鼻道、胃、盲肠为主要寄生虫；在小肠中发现有结肠，其形态为长梭，有时为梨状；动作迅速，3条相同长度的鞭毛在身体的前方，并有一条横穿整个身体的波膜。三毛滴虫（T.ro tun da）是一种寄生于盲肠、结肠的寄生虫，其形态一般为梨形，有时为圆形或卵形，其活动速度较猪三毛滴虫和巴特里毛滴虫慢，具有3条前鞭毛，长度基本相同，起伏膜的改变为光滑或波浪状。三毛滴虫（T.fo et us）是一种寄生在猪肠中的寄生虫，其外形为卵形，具3～6条前鞭和1条后鞭毛。

1.2.2 寄生于反刍动物的毛滴虫

三毛滴虫可在牛生殖道内寄生，而人五毛滴虫则能在牛、鹿的肠道内寄生。

1.2.3 寄生于犬猫等宠物的毛滴虫

三毛滴虫、人五毛滴虫等均能在犬、猫的肠道中传播。人五毛滴虫有感染人类和动物的危险。

2 毛滴虫的致病性及其危害

毛滴虫主要是在人体和脊柱的消化和排泄器官中传播，而在幼虫的营养期则是它的主要感染期，主要是由粪便、食物等途径传播，或者是由宿主传播，在宿主被感染后，会发生二次分化，以吸收渗出液、细菌等物质为养分，在适宜的环境下，培养基在适宜的环境中大量增殖，营养液呈圆形，鞭毛向内层分化，并在体外生成一个球状假囊泡，毛滴虫可附着于靶脏腺上皮，并可致毒，导致了靶脏癌的发生。人类五毛滴虫是一种寄生于哺乳动物体内的生物共患病的生物，经调查发现，人类五毛滴虫除了在犬猫之外，在其他种类的非灵长目和啮齿类的排泄物中也发现了人类五毛滴虫[3]。人五毛滴虫是由人和动物误吃而感染的，比如感染了人的饮水和食品，比如苍蝇等，感染后會出现痢疾、肺部感染、风湿性关节炎等。

本报告确认：阴道毛滴虫、口腔毛滴虫可引起结膜及脑脊液、肾脏的炎症，除了口腔的毛滴虫之外，还在肺、胸膜等部位存在着可引起呼吸道疾病的阴道毛滴虫和人五毛滴虫。猪毛滴虫可通过粪便接触、交配、污染饲料等途径传播，通过饮用水等途径进行传染，其隐性传染的比例很高，如果在不健康的环境下，可以发展成猪毛滴虫病，主要是以痢疾为主。

有研究显示，猪三毛滴虫会引起阴道炎、顽固性痢疾。三毛滴虫病是一种常见的寄生虫，可通过公牛或其精液传染给母牛，造成三毛滴虫病，造成不育症，早期流产，或子宫积脓。婴儿三毛滴虫会引起猫拉肚子，研究表明，不管猫咪有没有感染症状，都有三毛滴虫病。禽毛滴虫是一种常见的寄生虫，主要是在家禽、火鸡、鸽等动物的消化道上传播，可以通过饮水和饲料传播，一般是因为吃了鸽奶，也有可能是吃了带有虫子的鸽子而传染的。前胃发生坏死性溃疡，使上消化道、呼吸道堵塞，影响饮食和呼吸，从而导致动物死亡。近年来，我国的毛滴虫病发病率呈逐年上升趋势，一旦出现腹泻、不孕、生长迟缓或诱发其他疾病等多种症状，对我国养殖业的发展将产生很大的影响[4]。

3 材料与方法

3.1 样本

在开放式环境下，随机选取30只猕猴，其体形消瘦，脱水，粪便呈黄棕色。

3.2 仪器及试剂

日本（Olympus）、PCR（美国）、DNA电泳组（美国）、凝胶成像机（美国）。2 xTaqPCR MasterMix及粪便基因组 DNA的抽提仪、可再生胶液再生试剂盒、卢戈碘液染色剂。

3.3 显微镜观察

将1滴生理盐水滴入载玻片中心，用竹签将少量粪便蘸入生理盐水中，涂成一层薄薄的、均匀的粪膜，用光学显微镜观察其大体形态和营养液的形态。

3.4 毛滴蟲浓集

选择在低倍显微镜下，每一视场中的5只以上的毛滴虫营养体排样。用针筒将5ml的粪便样品在15ml的离心管中轻轻地抽出来，再加5ml的生理盐水，混合均匀，用一层消毒纱布滤掉2次；然后加入5ml的生理盐水和滤料混合，用2层或3层纱网过滤2遍，每隔一段时间将沉淀物除去，用3500r/min的离心机进行5min的分离。稍稍晃动，除去上部液体和中间的污物，在2ml的离心式管子底部沉淀1ml，加入1ml的生理盐水，在3500 r/min的条件下进行5min的离心，然后将剩余的液体丢弃。采用管底粗体标本进行碘溶液的浸渍及 DNA的抽取。

3.5 碘液染色

将浓缩后的试样10ml放于1.5ml的离心机中，然后加10µl卢戈碘溶液，混合均匀，放置30s，等染色后将10µl滴在玻璃杯上，用玻璃罩遮盖，放在一般的光学显微镜下。

3.6 猕猴毛滴虫基因组DNA提取及PCＲ鉴定

采用浓缩处理的管底物样品，根据样品规格进行了粪便 DNA抽取，测定 DNA含量>40ng/µl，OD260/OD280为1.7～2.0。

3.6.1 18SrＲNA基因序列扩增

三毛滴虫属18 SrRNA的引物：P1（5'-GCTCG TAGTCAGC-3'）；下游的引子P2（5’-CCCAATTAG AACTCTATCTC-3'）对18 SrRNA的基因进行了扩增。PCR反应系统：1ml的模板，12.5ml2 xTaqPCRMasterMix，1ml的上、下游引物和25ml的ddH2O，在72℃下延长5min。用1%的琼脂凝胶电泳法对10µm PCR产物进行鉴定，然后用胶再生试剂箱对目标 DNA进行分离，然后进行 DNA序列测定。

3.6.2 5.8SrＲNA基因序列扩增

五毛滴虫5.8 SrRNA的引物：P3（5’-TGCTTCAG TTCAGCGGTCTTCC-3'）；在此基础上，对（5'-CGG

TAGGTGAACCTGCCGTTGG-3'）进行了分析。PCR方法按3.6.1进行。PCR反应：94℃，5分钟前进行预处理；94、53、72℃、1min、35次。在72℃下延长5min。用1%的琼脂凝胶电泳法测定10µlPCR的结果。

3.7 序列比对分析与进化树构建

采用MegAlign软件和 BLAST方法进行了同源比对，并使用 MEGA7.0建立了一个系统演化树，对不同种源之间的亲缘关系进行了分析。

4 结果

4.1 形态观察

在高倍显微镜下，可以观察到大量的梨形、月牙形或类似卵形的虫体，它们的移动方向不确定，在虫体的末端有一条较粗的轴杆状突起，用碘溶液染色后，虫体的形状为卵形或梨形，虫体末节有一条鞭毛突出，称为后鞭毛；用油镜观察到的是昆虫的前鞭，但是用常规的光学显微镜很难准确地判别出鞭毛数。经形态学分析，从猴肠中分离出的毛滴虫可以被初步鉴定为猴源。

4.2 猕猴源三毛滴虫18 SrRNA和5毛滴虫5.8 SrRNA基因的克隆和序列分析

用1%的琼脂糖凝胶电泳法对 PCR产物进行了分析，结果表明，9份 PCR产物的目标基因条带在500～750 bp之间。对目标基因条带进行分离、测序，得到了三毛滴虫18 SrRNA基因序列，共656个 bp。用1%的琼脂糖凝胶电泳法对五毛滴虫5.8 SrRNA基因片段进行 PCR分析，没有得到300～400 bp的基因条带。利用 DNASTAR的 Clustalw方法，将18个 SrRNA序列与 GenBank上的代表性序列进行比较，结果显示，从腹泻狗的粪便中分离出的三毛滴虫（三毛滴虫）18 SrRNA序列（注册号：AY754332）与其基因序列的相似性最高[5]。

4.3 18SrRNA基因序列的系统演化树

结果：从猕猴粪中分离出的虫体与已报告的狗胚胎三毛滴虫18 SrRNA（注册编号：AY754332）和从污水中分离的人用三毛滴虫18 SrRNA（登记编号：KU939249），与其他毛滴虫的亲缘关系更近。通过对18 SrRNA基因序列的分析，确定了猕猴肠内的毛滴虫是猴源性三毛滴虫。

5 讨论

本文通过对猕猴的毛滴虫致病特性的分析，以及利用形态学和分子学相结合的方法对其进行鉴别的文献资料，为进一步的分析和评价该技术的应用奠定了基础。毛滴虫的一生很短，只有一种营养物质，它的典型特点是：1个梨状或椭圆状，2～4条或3～5条前鞭，1条后鞭毛。如果是在恶劣的环境中，比如突然的气温变化，或者是有药剂的作用，那么，营养液就会出现一些形态学上的变化，从而导致营养液的表层出现凹痕，并让鞭毛向营养体内凹陷。通过对30例猴子的粪便进行涂片法的研究，结果表明：被毛滴虫病1例、阿米巴原虫1例、感染鞭虫1例，其他均无发现，以毛滴虫为主要病原体。此次在猕猴体内见到的是一只蝌蚪形的毛滴虫，其移动方向是不确定的，前鞭毛2～5条，后鞭毛1条，但常规显微镜下难以正确识别，也没有三毛滴虫鞭毛。通过对其形态学的研究，可以将其作为猴源性的毛滴虫进行初步的研究。

在不同种类的情况下进行分类学的研究，对于临床上的疾病和疾病的诊治有着重大的指导作用，所以采用常规的形态学和分子生物学的方法进行分类学分析是比较科学的。采用三毛滴虫体18 SrRNA和5毛滴虫5.8 SrRNA的形态学方法，对毛滴虫进行了初步的检测，发现从猕猴体内提取的三毛滴虫体与狗胚胎中的18 SrRNA RNA有97.2%的相似性。结果表明，从猕猴体排泄物中得到的毛滴虫是三毛滴虫，采集样品中没有三毛滴虫与五毛滴虫的杂交。本实验为猕猴体内的肠道寄生虫病的诊治奠定了基础。

参考文献

[1] 王宏，赵德明，季维智，等.猕猴小袋纤毛虫形态学观察及分子生物学鉴定[J].中国兽医学报，2019，39（1）：7480.

[2] 李建华，韩红卫，宫鹏涛，等.猪三毛滴虫长春株的形态观察及其5.8SrＲNA基因分析[J].中国兽医科学，2019，40（2）：121-124.

[3] 陈玲霞，尹博文，李振宇，等.树鼩鞭毛虫的形态学观察及其18SrＲNA基因分析[J].中国比较医学杂志，2018，25（11）：58.

[4] 陈玲霞.树鼩肠道病毒宏基因组的初步研究及毛滴虫的鉴定[D].中国医学科学院北京协和医学院，2017.

[5] 孟莹.犬源毛滴虫的分离鉴定及其生物学特性研究[D].吉林大学，2019.