毛滴虫病诊断技术研究进展

朱易斌,蔡海明,魏光伟,廖申权,戚南山,李 娟,吕敏娜,林栩慧,胡俊菁,张健騑,陈进军,孙铭飞*

(1.广东海洋大学,广东湛江 524088;2.广东省农业科学院动物卫生研究所,农业农村部禽流感等家禽重大疾病防控 重点实验室,广东省畜禽疫病防治研究重点实验室,广东广州 510640)

毛滴虫为寄生于人和脊椎动物消化道或泌尿生殖道等的一类原生动物,毛滴虫科的各属包括致病和共生两大类,寄生于人的毛滴虫包括阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis)、人五毛滴虫(Pentatrichomonashominis)、口腔毛滴虫(Trichomonastenax)和脆弱双核阿米巴(Dientamoebafragilis),其中阴道毛滴虫是寄生于人的毛滴虫中致病性最强、危害性最大的一类毛滴虫[1]。人感染毛滴虫后会出现腹痛腹泻、尿频尿急、生殖功能障碍等症状。寄生于动物的毛滴虫包括禽毛滴虫(Trichomonasgallinae) 、胎儿三毛滴虫(Tritrichomonasfoetus)、猪三毛滴虫(Tritrichomonassuis)、巴特里四毛滴虫(Tetratrichomonasbuttreyi)和人五毛滴虫(P.hominis)等[2-3]。动物感染毛滴虫后会出现腹泻、生长发育迟缓、流产不孕等症状,给养殖业造成了巨大的经济损失,严重影响畜牧业发展。其中人五毛滴虫作为人兽共患毛滴虫存在公共卫生传播风险,因此对于毛滴虫病的准确诊断尤为重要,快速准确地诊断对该病的早期防治也起到关键作用。目前对于毛滴虫病的诊断方法有镜检法、培养法、染色法及分子生物学方法等,但各种方法存在较大差异。本文综述不同毛滴虫病诊断方法的原理、优势和不足,为该病的诊断提供参考。

1 临床诊断

毛滴虫感染后宿主常出现不同程度的临床症状(表1),根据不同临床症状和病理变化可初步做出诊断,鸽感染毛滴虫后出现羽毛松乱、精神沉郁、食欲减退、呼吸困难、腹泻等症状,剖检发现口腔、咽部、食道上段及嗉囊黏膜表面局灶性或弥漫性溃疡,小肠肿大,肠黏膜充血出血[4]。临床上鸽毛滴虫病容易与鸽痘、鸽念珠菌病、鸽维生素缺乏症等混淆,因此想要做到准确诊断鸽毛滴虫病必须结合实验室诊断。暹罗猫被毛粗乱、腹泻、粪便中偶见血液,超声检查其大肠皱褶局部淋巴结肿大[5],在结肠病灶部位分离到胎儿三毛滴虫,实验室确诊为胎儿三毛滴虫感染。一名68岁的法国高加索人患有发热、黏液性腹泻、关节疼痛等临床症状,后经实验室检查确诊为人五毛滴虫阳性感染[6]。因此临床诊断与实验室诊断相结合能够更准确地诊断毛滴虫病。

表1 部分毛滴虫感染的主要临床症状及病理变化

2 实验室诊断

2.1 压滴标本镜检法

压滴标本镜检法主要是将采集的粪便、肠内容物或鼻咽、阴道分泌物等检测样品均匀涂抹在载玻片上,然后滴加1～2滴生理盐水,加盖玻片后在不同倍数的物镜下观察。在100×镜下可观察到梨形或者卵圆形快速游动的虫体,而在400×镜下可观察到毛滴虫的形态结构。但是由于不同种的毛滴虫形态结构相似,单一利用镜检法并不能区分毛滴虫的种类,无法做到精确地鉴别毛滴虫,且在宿主早期感染时虫体数量较少容易存在漏检现象。因此,需要其他检测方法进一步鉴定。

2.2 体外培养法

通过对毛滴虫进行体外培养后使虫体数量增加从而准确地检测毛滴虫,该方法可在感染早期虫体数量较少时提高检测的准确率。用肝浸汤培养结合显微镜检法对广东省各地共296份鸽口腔黏液样品进行毛滴虫感染调查,鸽毛滴虫平均感染率为38.9%[7],其中乳鸽感染率最高为51.3%,青年鸽为48.7%,而种鸽感染率为18.1%,证明该方法比传统的镜检法检测准确率高且成本低。已报道的适合毛滴虫培养的培养基有很多,如肝浸汤培养基、克劳森培养基、Diamond培养基、蛋黄浸液、TY1-S-33培养基、鸡蛋白柠檬酸钠培养基、DMEM培养基等[8]。不同的培养基对毛滴虫的培养存在一定的差异,因此可以利用体外培养来区分不同的毛滴虫。用DMEM培养基和肝浸汤培养基分别培养阴道毛滴虫,存活时间远高于肝浸汤培养基,但增殖率低于肝浸汤培养基[9]。毛滴虫比较脆弱,生长条件苛刻,且虫体死亡后迅速降解,因此选择合适的培养是诊断毛滴虫病的关键。体外培养法的准确率高于镜检法且成本较低,该方法也为后续毛滴虫的研究提供了宝贵的虫种资源。但是因为体外培养周期较长,不能达到快速诊断的目的,因此体外培养法也存在一定的局限性。

2.3 染色镜检法

染色镜检法可用不同染液对毛滴虫进行染色进而更清晰地观察其形态结构,达到准确诊断的目的。目前可用于毛滴虫的染色方法有很多(表2)。不同染色方法对毛滴虫的染色效果不一样,所以选择正确合适的染色方法更有利于观察毛滴虫的形态结构。但因部分毛滴虫形态结构差异不大,染色镜检法也很难达到种属鉴定,因此该方法主要作为不同毛滴虫病诊断的辅助手段,想要做到更精确的诊断毛滴虫病还需要进一步借助分子生物学方法。

表2 不同毛滴虫染色方法比较

2.4 分子生物学方法

2.4.1 普通PCR检测法 PCR技术具有特异性强和灵敏度高的优点,该方法也常用于毛滴虫病的诊断(表3)。PCR检测方法主要通过扩增毛滴虫的特异性或具有遗传分型特性的核酸序列(18S rRNA基因、5.8S rRNA基因和EF-1α基因等[13])后进行遗传分析进而达到种水平鉴定。PCR检测技术的高灵敏性,使毛滴虫感染早期便能准确检测。根据毛滴虫TV-E650-1基因设计了1对引物,并建立了一种检测阴道毛滴虫的方法,PCR扩增出438 bp的目的片段,对模板稀释1 000倍后仍能明显扩增,表明此方法特异性强,灵敏度高,可作为体外诊断阴道毛滴虫病及进行流行病学调查的候选方法[14]。套式PCR(nested-PCR)是一种特殊的聚合酶链式反应,其原理是利用2对引物进行目的片段扩增,第2对套式引物结合在第1次PCR产物内部,降低PCR反应过程中的错误扩增,因此其具有比普通PCR更特异的优点。基于人五毛滴虫EF-1α和18S rRNA基因分别建立两种套式PCR方法,对139份鹿粪便样品进行检测,结果显示其适合临床上人五毛滴虫感染检测,而基于18S rRNA基因的套式PCR方法则更适合用人五毛滴虫基因亚型的鉴定[15]。但是套氏PCR需进行两轮扩增,过程比普通PCR繁琐,但其灵敏性高于普通PCR,因此两种方法都是近年诊断毛滴虫病的主要方法。

表3 毛滴虫PCR检测及阳性率统计

2.4.2 实时荧光定量PCR检测法 实时荧光定量PCR(qPCR)是在DNA扩增反应过程中,用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该方法与传统PCR方法相比具有更加灵敏、快速等优点,已作为兽医寄生虫学中一种诊断、定量分析和标准化基因表达的有效工具[16]。基于SYBR green染料建立一种通过扩增18S rRNA基因的113 bp区域来检测禽毛滴虫的实时荧光PCR方法,并绘制标准曲线定量分析其扩增效率,该方法可用于临床上禽毛滴虫感染的检测[17]。实时荧光定量PCR检测方法具有更加灵敏特异的优点,但其作为一种诊断方法所需仪器设备和试剂要比普通PCR更加昂贵,因此该方法也很少用于毛滴虫病的诊断。

2.4.3 环介导等温扩增检测法 环介导等温扩增(loop-mediated isot hermal amplification,LAMP)是一种新的核酸扩增基因的检测方法,该方法也被用于多种毛滴虫病的诊断,用检测阴道毛滴虫的LAMP方法对121名女性进行阴道毛滴虫流行病学调查,检出率(42.06%)高于培养法(8.26%)和PCR方法(7.44%)[30]。对比PCR方法和LAMP方法,两种方法都可用于阴道毛滴虫病的诊断,且特异性都很高。但LAMP方法的灵敏度优于PCR方法[31]。根据口腔毛滴虫的ITS和5.8S rRNA基因设计特异性引物,建立一种用于检测口腔毛滴虫的LAMP方法,该方法特异性和灵敏度均高于普通PCR方法[32]。LAMP方法也被用于检测胎儿三毛滴虫。LAMP方法与常规PCR相比减少了模板热变性、温度循环以及电泳过程,且检测成本远低于荧光定量PCR,具有简单、快速、特异性强、灵敏度高等特点。

2.4.4 原位杂交检测法 用核酸碱基对的互补配对原则将标记好的外源性核酸与细胞、组织的待测目的序列进行碱基配对互补,结合成带有标记的目的基因的杂交核酸分子,再利用特定的方法进行检测。显色原位杂交方法可直接从寄生组织中检测到毛滴虫,并对其寡核苷酸探针进行设计和评估,理论上可以检测到滴虫目的所有已知成员。有研究设计3种探针,用显色原位杂交技术对102只猫的肠组织切片进行毛滴虫检测,结果在102只猫中检测到3只猫的胎儿三毛滴虫呈阳性,1只猫的人五毛滴虫呈阳性,在对阳性猫的肠组织剖检时发现肠腔内有大量毛滴虫,并侵入肠黏膜。但是原位杂交检测法操作较为繁琐且灵敏度低于PCR检测法,不经常用于临床上毛滴虫病的诊断。

2.5 其他检测方法

对于毛滴虫病的诊断方法还有血清学方法。商品化的ELISA检测试剂盒通常采用直接免疫测定的方法,通过过氧化氢酶标记的单克隆抗体与多种阴道毛滴虫的蛋白进行抗原抗体反应,其检出率与培养法相同。建立一种鸽毛滴虫感染Dot-ELISA检测方法,对70个临床样品进行检测,结果48个镜检阳性的样品用Dot-ELISA检测有44个呈阳性,阳性符合率91.7%,22个镜检阴性的样品检测出12个呈阴性,阴性符合率54.5%,Dot-ELISA检测与镜检结果的总符合率为80%。用牛源T.foetus的TF1.17抗原的1.15和1.17表位产生的单克隆抗体,评估TF1.17在猫源T.foetus的存在和作用,用免疫印记、免疫荧光分析和流式细胞术分析证实猫源T.foetus中TF1.17抗原的存在,表明TF1.17抗原也可能作为诊断和预防猫源T.foetus感染的靶点。美国唯一获得FDA批准的用于检测阴道毛滴虫的方法OSOM滴虫免疫检测法,该方法可在10 min内达到有效诊断,使其成为比镜检法,培养法和ELISA法更灵敏和快速,但其特异性低于PCR检测法。

3 展望

毛滴虫的感染范围广,人源毛滴虫对人类健康造成极大的威胁,动物源的毛滴虫对我国的养殖业带来了巨大的经济损失,严重阻碍我国畜牧业的发展。人兽共患毛滴虫形成了一条人畜传播链,造成一定的公共卫生传播风险。因此快速准确地诊断毛滴虫病就显得尤为重要,而单一的湿片镜检已经不能满足毛滴虫病的准确诊断,体外培养法和湿片镜检法相结合能够提高检测的准确率,也为毛滴虫后续研究提供了宝贵的虫种资源,但其培养周期较长不能快速做出诊断,PCR方法灵敏性高、特异性强的优点使其成为诊断毛滴虫病的首选方法,该方法可以快速准确地诊断毛滴虫病,为毛滴虫病的早期防治起到了关键作用,也为毛滴虫的后续研究提供了技术支持,是普遍选择的检测毛滴虫的方法。目前对于毛滴虫病的诊断方法已经有了很大的发展,但部分诊断方法仍存在不足,未来有望开发出更加快速准确地诊断毛滴虫病的新方法。