膀胱癌中miR-128与血管内皮生长因子C的靶向调控关系

祖雄林，周旭，陈金波，崔雨，齐琳

（中南大学湘雅医院1.国际医疗部；2.泌尿外科，湖南 长沙 410008）

·论著·

膀胱癌中miR-128与血管内皮生长因子C的靶向调控关系

祖雄林1，周旭2，陈金波2，崔雨2，齐琳2

（中南大学湘雅医院1.国际医疗部；2.泌尿外科，湖南 长沙 410008）

目的研究人膀胱尿路上皮癌细胞和组织中的miR-128与血管内皮生长因子C（VEGF-C）的靶向调控关系及其生物学功能。方法收集9对配对的膀胱癌组织和其癌旁组织，1株人正常尿路上皮细胞（SV-HUC-1）和4株膀胱癌细胞（T24、5637、UM-UC-3和RT4），通过RT-PCR、Western Blot方法检测VEGF-C和miR-128的表达水平；将miR-128复合物或miR-128抑制剂等复合物转染到2株膀胱癌T24和5637细胞中，检测miR-128对其生长、迁移及侵袭的影响；生物信息学软件预测分析miR-128的靶基因，双荧光素酶实验验证miR-128是否靶向作用VEGF-C。结果相比癌旁组织和正常尿路上皮细胞，膀胱癌组织和细胞中miR-128的表达明显下调（P＜0.05），而VEGF-C在癌组织和细胞中都呈现高表达（P＜0.05）。miR-128可抑制膀胱癌细胞生长、克隆形成及迁移侵袭（P＜0.05）。双萤光素酶报告实验证实miR-128靶向作用VEGF-C（P＜0.05）。结论miR-128在膀胱癌中表达下调，而VEGF-C表达上调；miR-128可通过靶向调控VEGF-C影响膀胱癌细胞的增殖和转移。

miR-128；血管内皮生长因子C；膀胱癌；靶向调控

膀胱癌（bladder cancer，BC）是泌尿生殖系发病率第二的肿瘤[1]。大约有50%的患者被诊断为肌层浸润性膀胱癌，伴有肺部和肝脏等远处转移，导致5年生存率较低[2]。目前，进一步提高生存率的治疗方法比较有限，肿瘤转移的潜在机制目前没有明确。

小分子核糖核酸（microRNA）是内源性的微小RNA分子，通过调节基因的表达，在肿瘤发生中扮演重要的角色。微小RNA128（microRNA128，miR-128）是一种双面miRNA，目前在神经胶质瘤中研究最多。它可以通过靶向作用于Bmi-1（B-cell specific moloney leukemiavirus insertion site 1，Bmi-1）、E2F3a（E2F transcription factor 3 a，E2F3a）和促有丝分裂的激酶抑制神经胶质瘤细胞增殖和生长[3]。此外，miR-128可靶向作用于p70S6K1（p70 ribosomal protein S6 kinase 1，p70S6K1）抑制肿瘤生长和血管生成[4]，在大多数情况下，miR-128是抑癌基因，例如miR-128可降低神经母细胞瘤、前列腺癌细胞的能动性和侵袭性[5-6]。但目前还罕有关于miR-128在膀胱癌中的作用的报道。

血管内皮生长因子C（vascular endothelial growth factor c，VEGF-C）与血管生成、淋巴管生成和区域淋巴结转移有关，被报道有抗凋亡和增殖的作用[7]。RNA干扰VEGF-C能抑制恶性进展和提高丝裂霉素C对膀胱癌T24细胞的敏感性[8]，但膀胱癌中miR-128和VEGF-C之间的关系仍然未知。因此，本研究拟确定膀胱癌组织和细胞中miR-128和VEGF-C的表达水平，研究miR-128在5637、T24细胞增殖、迁移和侵袭中的作用。验证在T24和5637细胞株中，miR-128与VEGF-C的靶向作用关系，为膀胱癌的诊断或治疗寻找新的分子靶标。

1 材料和方法

1.1材料

选取中南大学湘雅医院泌尿外科2013年10月-2014年4月的9例膀胱癌患者癌组织和癌旁组织标本，均来自于膀胱肿瘤患者的手术切除组织。取术中切除的膀胱肿瘤组织，同时随机采取于距离肿瘤边缘2 cm以外的癌旁组织。所有标本均由病理科医生根据组织切片作出病理诊断为膀胱癌。所有患者术前未行放疗和化疗。膀胱癌细胞株T24、5637、UM-UC-3、RT4及正常尿路上皮细胞系SV-HUC-1等细胞株均购自于中南大学湘雅医学院细胞中心及代购自美国ATCC公司。

1.2方法

1.2.1实时荧光定量多聚核苷酸链式反应按照说明书步骤用Trizol试剂从细胞试剂盒中提取收集细胞、膀胱癌组织及癌旁组织中的总RNA，选取A260/A280比值在1.8～2.0之间的RNA标本进行逆转录。用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，Real time PCR）检测miR-128和VEGF-C的相对表达量。特殊引物miR-128（HmiRQP3056）和U6（HmiRQP9001）、miR-128复合物（miR-128 mimics）或抑制剂（inhibitor）及阴性对照组（negative control，nc）由广州复能公司合成。配对引物序列具体如下：VEGF-C转录引物：5'-CACGAGCTACCTCAGCAAG A-3'，逆转录引物：5'-GCTGCCTGACACTGTGGTA-3'；β-actin作为内参，转录引物：5'-AGGGGCCGGA CTCGTCATACT-3'和逆转录物：5'-GGCGGCACCA CCATGTACCCT-3'。使用GraphPad Prism 4.0软件和2-ΔΔCt求基因相当表达量方法，分析VEGF-C mRNA和mir-128的表达水平。

1.2.2蛋白分离和免疫印迹试验通过免疫印迹试验（Western blot）对蛋白表达水平进行量化分析。采用凝胶电泳等方法处理蛋白样本，然后用β-actin（1∶500）兔多克隆抗体，anti-VEGF-C（1∶500）兔多克隆抗体进行检测。适量TBST溶液漂洗10 min× 3次后，暗室内浸入ECL液显色，并使胶片曝光，定影，洗片。由凝胶图像扫描系统对扩增产物的电泳条带胶片进行密度扫描，用图像分析软件IPP 6.0对图像进行曝光灰度分析。

1.2.3细胞转染按照说明书使用脂质体转染试剂，在转染12 h前先将细胞铺到六孔板中。高效稳定转染阴性对照、miR-128 mimics或miR-128 inhibitor入膀胱癌T24和5637细胞中，在培养箱中孵育48 h，以利下一步实验进行miR-128的功能分析。

1.2.4细胞增殖试验细胞生长增殖能力是通过四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法来检测的。取转染后的膀胱癌T24或5637细胞，细胞分组（NC、inhibitor或mimics组）进行消化，调制成细胞悬液，铺96孔细胞培养板，每孔2×103个细胞。在每个反应孔加入20μl浓度为5 mg/ml的MTT溶液，培养4 h，再去上清液，每孔加入150μl DMSO溶液沉淀，培养10 min，用酶标仪检测各孔的吸光值，测定波长为570 nm。

1.2.5 平板克隆形成试验膀胱癌T24、5637细胞分组（NC、inhibitor或mimics组）进行消化，调制成细胞悬液，按照50个细胞/ml细胞悬液接种到每个六孔培养板中。置于细胞培养箱中培养14 d后漂洗染色，培养条件为37℃，5%二氧化碳CO2。克隆计数，计算克隆形成率，比较克隆形成能力。

1.2.6细胞侵袭实验膀胱癌细胞体外侵袭能力的评估在24孔板Transwell小室中进行。细胞分组及准备如前所述，加入200μl细胞悬液（1×106细胞/ml）至小室内。培养染色后，冲洗干燥Transwell小室，用酶标仪测定各孔的OD值，测定波长为570 nm。

1.2.7细胞迁移实验使用划痕修复实验评估细胞的迁移能力。细胞培养并转染后，检测其划痕修复情况。划痕宽度约1 mm，在无血清培养基中进行细胞清洗和培养。以划痕时间为起点，在0、24和48 h分别在显微镜下观察各组细胞划痕修复情况。

1.2.8双荧光素酶报告分析软件预测显示VEGF-C基因的3-UTR包含mir-128的结合位点，通过DNA聚合酶以基因组DNA为模板进行PCR克隆扩增。再在NotⅠ和XhoⅠ这2个酶切位点间插入到psiCHECKTM-2质粒中，其相应的突变序列克隆到psi-CHECKtm-2，分别名叫VEGF-C-3'-UTR和Mut-VEGF-C-3'-UTR。使用脂质体2000（表达载体），T24、5637细胞共转染报告质粒和miR-128模拟物，miR-128抑制剂，阴性对照组或阴性对照抑制剂等。荧光素酶活性被确定于48 h后，使用Promega公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System进行样品荧光素酶的活性检测。

1.3统计学方法

2 结果

2.1miR-128和VEGF-C的表达

miR-128在膀胱癌组织和癌细胞中低表达，而VEGF-C则是高表达。相比邻近正常组织，膀胱癌组织中miR-128的mRNA水平明显低于正常组织，而VEGF-C的mRNA水平是相反的（P＜0.05，图1A和2A）。与此同时，与正常膀胱移行上皮细胞株SV-HUC-1相比，膀胱癌细胞中可见mir-128表达下调和VEGF-C表达上调（P＜0.05，图1B和2B）。免疫印迹分析，与癌旁组织和SV-HUC-1相比，膀胱癌组织和癌细胞株的VEGF-C蛋白表达明显增加（P＜0.05，图2C和2D）。这些结果表明，在膀胱癌的恶性进展中，miR-128可能发挥了重要作用。此外，VEGF-C上调和miR-128下调的共存提示膀胱癌细胞中潜在的调控相关性。

图1 miR-128 mRNA的表达水平比较

2.2miR-128的过表达可以减少膀胱癌T24和5637细胞中VEGF-C的表达

通过体外转染miR-128 mimic的方式来进行细胞功能实验，了解miR-128在膀胱癌T24、5637细胞中的功能。转染pre-mir-128后，mir-128的mRNA水平显著上调而VEGF-C的mRNA水平下调（P＜0.05）。与之相反，当转染anti-mir-128，mir-128的mRNA水平下调和VEGF-C的mRNA水平上调（P＜0.05）。这表明mir-128的过表达可以减少膀胱癌T24和5637细胞中VEGF-C的表达。见图3。

图2 VEGF-C mRNA和蛋白的表达水平比较

图3 mir-128和VEGF-C在膀胱癌T24和5637细胞功能模型中的表达

2.3 miR-128在膀胱癌T24和5637细胞中直接靶向作用VEGF-C

克隆扩增包含miR-128结合位点的VEGF-C-3-UTR片段和变异的目标序列，通过psi-CHECK2双荧光素酶报告基因载体，共转染miR-128复合物到膀胱癌T24和5637细胞。结果显示，miR-128模拟物抑制转染了野生型即VEGF-C-3-UTR的T24和5637细胞的荧光素酶活性。然而，miR-128模拟物没有抑制转染了突变型即Mut-VEGF-C-3-UTR的T24和5637细胞的荧光素酶活性，见图4。这证实了VEGF-C是miR-128的直接靶基因。

2.4miR-128抑制膀胱癌细胞的生长和克隆形成能力

为了解miR-128对细胞的影响，通过miR-128模拟物或其抑制剂转染膀胱癌T24和5637细胞，利用MTT比色实验和平板克隆形成实验检测细胞生长和克隆形成能力，与阴性对照转染细胞组相比，膀胱癌细胞中miR-128的过表达显著降低了T24和5637细胞的生长率（图5A和5B）和克隆形成能力（图5C和5D）。然而，相比阴性对照组，miR-128转染抑制剂组细胞的生长率和克隆形成显著增加。它表明miR-128可以抑制膀胱癌T24和5637细胞的生长增殖。

2.5miR-128抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力

通过Transwell小室和划痕修复实验测定细胞的迁移和侵袭能力。结果显示，当膀胱癌T24和5637细胞转染miR-128过表达物后，细胞迁移和侵袭能力明显更强，当膀胱癌T24和5637细胞转染miR-128抑制剂后，细胞迁移和侵袭能力显著降低，见图6。结果表明，miR-128可以抑制膀胱癌T24和5637细胞的迁移和侵袭能力。

图4 mir-128反向调控VEGF-C的表达

图5 miR-128对膀胱癌细胞生长增殖的影响

图6 miR-128对膀胱癌细胞迁移和侵袭能力的影响

3 讨论

膀胱癌是泌尿生殖系统常见肿瘤，膀胱癌患者多以尿路上皮细胞癌的病理类型居多，具有易浸润、易转移、易复发等特点[9]。目前，在已有的治疗方案下提高存活率的进展是有限的，这很大程度上是由于致肿瘤转移的机制还不是很清楚。因此，探索关键因素介导的膀胱癌生长和转移的分子机制对于开发有效的治疗很重要。研究人员一直在寻找新的生物标志物，其中一个重要的研究方向是microRNAs（miRNAs）在膀胱癌的发生发展过程中的表达及作用。

MiRNAs是不翻译成蛋白的小RNA分子，成熟的miRNA约18～22个核苷酸的长度。研究发现这些miRNA表达情况不仅在恶性肿瘤与正常组织之间存在差异表达，在不同类型的癌症之间及相同癌症的不同亚型都不同[10]。因此，miRNAs被认为具有成为癌症早期诊断或预测生物标记的潜力，它们或许能作为不同肿瘤疾病的治疗靶点[11]。在不同组织或细胞中，miR-128被发现是一种有双面性的微小RNA。在大多数情况下，它作为抑癌基因，其功能包括调节细胞增殖、迁移、凋亡和耐药性，但对其在膀胱癌的表达和功能研究是非常有限的[12]。

本研究检测了9例膀胱癌组织及癌旁组织中miR-128的mRNA表达水平。结果表明，相比癌旁组织，miR-128在膀胱癌中的表达显著降低。与此同时，与正常尿路上皮细胞相比，它在4株膀胱癌细胞中的表达均下调。这表明，在膀胱癌中，miR-128可能是一个抑癌基因。分别在膀胱癌T24和5637细胞中转染pre-mir-128和anti-mir-128，构建了功能获取和功能抑制的细胞模型，以进一步研究mir-128在膀胱癌中的生物学功能。使用MTT比色实验、平板克隆形成试验、划痕修复实验和Transwell小室实验，本研究发现miR-128可以抑制膀胱癌T24和5637细胞的生长，增殖、迁移和侵袭能力。这些结果与之前在其他肿瘤中的研究是一致的[5，13]。

VEGF-C与血管生成、淋巴管生成和区域淋巴结转移有关，被报道有抑制凋亡和增殖的作用[14]。由生物信息学软件预测，VEGF-C是miR-128的目标基因之一，并且在部分肿瘤中得到了验证。在人类非小细胞肺癌的肿瘤生成、血管生成和淋巴管生成中，miR-128可直接靶向作用于VEGF-C，并起着至关重要的作用[15]，但是miR-128、VEGF-C之间的关系在膀胱癌中仍然是未知的。本研究使用双荧光素酶基因报告分析，验证了膀胱癌T24和5637细胞中miR-128和VEGF-C之间的直接靶向关系。

综上所述，本研究初步证明了膀胱癌组织和细胞中，miR-128是显著下调的，而VEGF-C显著上调；膀胱癌细胞中miR-128直接靶向作用于VEGF-C，从而影响膀胱癌的进展。这说明miR-128可作为膀胱癌诊疗的一个新方向。虽然本研究提示了膀胱癌中miR-128靶向调控VEGF-C这一信号通路可能的分子机制，但是还需要进一步的研究来阐明其具体机制。下一步将采取加大样本量、构建VEGF-C稳定沉默的细胞模型和进行体内动物实验的方法来深入探讨miR-128在膀胱癌中的生物学功能、作用机制及临床意义。

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（王荣兵 编辑）

Mir-128 is down-regulated in bladder cancer and inhibits tumor cell proliferation by targeting VEGF-C

Xiong-lin ZU1,Xu ZHOU2,Jin-bo CHEN2,Yu CUI2,Lin QI2
(1.International Medical Center;2.Department of Urology,Xiangya Hospital,Central South University,Changsha,Hunan 410008,P.R.China)

【Objective】To investigate the regulation of miR-128 on VEGF-C expression and its biological effect in bladder cancer.【Methods】Materials including 9 pairs of bladder cancer tissues and adjacent tissues,4 bladder caner cell lines(T24,5637,UM-UC-3,RT4)and 1 normal urothelial cell(SV-HUC-1)were collected.The miR-128 and VEGF-C mRNA and protein expression were tested by RT-PCR and Western blot,respectively.The miR-128 minics and miR-128 inhibitor were transfected into bladder cancer cells T24 and 5637 through lipidosome.And the effect of miR-128 on bladder urothelial cancer cells proliferation,invasion and metastasis were tested.Target gene of miR-128 analysis was applied by related biological information software.Dual luciferase reporter gene assay verified targeted relationship between miR-128 and VEGF-C.【Results】We found miR-128 was down-regulated in bladder cancer tissues and cell lines which was opposite from the expression of VEGF-C(P<0.05).Overexpression of miR-128 could inhibit proliferation,migration and invasion of bladder cancer cells(P<0.05).Dual luciferase reporter gene assay showed VEGF-C was a direct target of miR-128 in bladder cancer cells(P<0.05).【Conclusions】miR-128 was down-regulated in bladder cancer,meanwhile VEGF-C was up-regulated.MiR-128 downregulation can promote the growth and metastasis of bladder cancer cells by involving VEGF-C up-regulation.

miR-128;VEGF-C;bladder cancer;target regulating

R737.14

A

1005-8982（2015）25-0038-07

2015-06-10

周旭，E-mail：zx315zx@163.com