七氟醚预处理对脊髓缺血再灌注大鼠5脂氧合酶表达的影响*

欧军，赵红，谢红，姚平波，苏小桃，何军，何俊

（1.南华大学附属南华医院脊椎外科，湖南 衡阳 421002；2.南华大学护理学院基础护理教研室，湖南，衡阳 421001）

·论著·

七氟醚预处理对脊髓缺血再灌注大鼠5脂氧合酶表达的影响*

欧军1，赵红2，谢红1，姚平波1，苏小桃1，何军1，何俊1

（1.南华大学附属南华医院脊椎外科，湖南 衡阳 421002；2.南华大学护理学院基础护理教研室，湖南，衡阳 421001）

目的探讨七氟醚预处理对大鼠脊髓缺血再灌注损伤时5脂氧合酶（5-LOX）表达的影响。方法雄性成年SD大鼠45只，体重250～300 g，采用随机数字表法，将大鼠随机分为3组（n=15）：假手术组（S组）、脊髓缺血再灌注组（I/R组）和七氟醚预处理组（I组）。采用胸主动脉球囊阻断+体循环低血压法制备大鼠脊髓缺血再灌注模型。I组吸入3.4%七氟醚2 h，24 h后制备模型。于再灌注24 h时采用神经功能缺陷评分（NDS）法评价大鼠神经功能，随后处死取脊髓，分别采用Western blot法和RT-PCR法测定5-LOX、p-ERK1/2和t-ERK1/2蛋白及其mRNA的表达水平。应用ELISA检测血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的含量。结果与S组比较，I/R组和I组神经功能缺陷评分升高，I/R组5-LOX和p-ERK1/2蛋白及其mRNA表达上调，TNF-α含量升高，I组5-LOX mRNA和p-ERK1/2蛋白及其mRNA表达上调（P＜0.05）；与I/R组比05）。结论七氟醚预处理可能通过下调5-LOX表达，抑制ERK1/2信号通路，从而减轻大鼠脊髓缺血再灌注损伤。

生四烯酸盐5-脂氧合酶；七氟醚；缺血预处理；再灌注损伤；脊髓

研究表明脊髓缺血再灌注损伤与炎症因子的释放、细胞内外离子紊乱、自由基及脂质过氧化、兴奋性氨基酸及细胞凋亡蛋白的表达等密切相关。因此，针对脊髓再灌注损伤中神经细胞靶向药物治疗是挽救脊髓功能的关键点。与此同时，脊髓缺血再灌注损伤在严重创伤或术中发生出血性休克患者的临床病理生理过程中发挥关键性的作用。因此，此类手术的麻醉药选择除了能达到满意的麻醉疗效外，还应具有脊髓保护作用[1-3]。七氟醚作为吸入性临床常用的麻醉药，在动物和细胞实验研究均表明，七氟醚预处理可减轻脊髓缺血再灌注损伤[4-5]。5-脂氧合酶（5-lipoxygenase，5-LOX）是脂类信号分子生物合成过程中的关键酶，参与了脊髓缺血再灌注损伤的病理生理过程[6-8]。七氟醚预处理减轻脊髓缺血再灌注损伤的机制是否与5-LOX有关尚有待研究。本研究拟探讨七氟醚预处理对大鼠脊髓缺血再灌注时5-LOX表达的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物

SPF级SD大鼠，雄性，体量250～300 g，由南华大学实验动物部提供。

1.2主要试剂和仪器

RNA反转录试剂盒和SYBR试剂（瑞士罗氏公司），3.4%七氟醚（雅培制药有限公司），实时荧光定量PCR仪（瑞士罗氏公司），蛋白提取试剂盒（广州市锐博生物科技有限公司），p-ERK1/2、t-ERK1/2以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（Santa Cruz，USA），ELISA试剂盒购自广州市锐博生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1动物分组成年雄性SD大鼠45只，采用随机数字表法，将大鼠随机分为3组（n=15）：假手术组（S组）、脊髓缺血再灌注组（I/R组）和七氟醚预处理组（I组）。3组均为普通饲料饲养，自由饮水。1.3.2小鼠脊髓缺血再灌注损伤模型的建立腹腔注射4%水合氯醛0.1 mg/kg麻醉，智能恒温控制仪维持大鼠体温36～37℃；大鼠在特制喉镜直视下行气管插管，连接动物呼吸机行呼气末正压通气，吸入氧浓度32%～34%，参考动脉血气情况以维持pH值7.35～7.45、PaCO235～45 mmHg、PaO290～150 mmHg来调节呼吸频率或潮气量。采用充满含肝素生理盐水（IU/ml）的导管成功穿刺大鼠右颈内动脉和尾动脉并分别连接有创动脉血压监测器，便于监测动脉血压。右股动脉分离后，将顶端1.0～3.0 cm处有可充气球囊的2 F微球囊导管从右股动脉切开处置入，逆行插入10.5 cm到达胸主动脉降部。颈内动脉导管与可加热的血液收集循环装置连接（装置包括一个53.0 cm含肝素生理盐水的垂直柱）。2 F微球囊导管用0.05 ml的生理盐水膨胀阻塞动脉，当胸主动脉降部被阻塞的同时，开放右颈内动脉，动脉血可以回流进入肝素化柱内，维持前右颈内动脉均动脉压于40 mmHg，尾动脉血压降至6～7 mmHg时确认动脉阻塞完全。维持阻塞时间10 min，阻塞完成后将肝素化柱内的血液缓慢回输入大鼠体内（时间＞1 min），在上述操作完成后所有大鼠均给予200 u的肝素钠，并给予4 mg硫酸鱼精蛋白，将2 F微球囊导管拔出，无菌外科缝合伤口，大鼠恢复自主呼吸后拔除气管导管回笼。

I组大鼠先进行七氟醚预处理：自制有机玻璃箱，箱体一侧靠近底部留有进气口，另一侧靠近顶部留有出气口。进气口处插入1根连接麻醉气体挥发罐的管子并予以ULT-1工型麻醉气体监测仪监测七氟醚的浓度，持续输入含有3.4%七氟醚的氧气，气体流量为5 L/min；出气口端连接ULT-1工型麻醉气体监测仪监测七氟醚的浓度。在箱底放入适量钠石灰，预充气体，待出口气体七氟醚浓度维持3.4%时，放入大鼠，吸入混合气体2 h。预处理结束后24 h时制备大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型。

1.3.3神经功能缺陷评分（neurological deficit scores，NDS）由2名专业人员（严格限制评分人员知晓实验方法及预期疗效）分别独立进行，并于再灌注24 h时采用NDS评分法评价大鼠神经缺陷功能。Tarlov评分：0分：行走正常；1分：可行走，仅有轻度障碍；2分：后肢可支持体重，能行走1、2步；3分：不能负重，后肢活动频繁或有力；4分：不能负重，但后肢可见活动；5分：不能负重，后肢无活动。翻身评分：0分：鼠背部放置后立即翻正；1分：不能翻正。位置评分：0分：当大鼠在空中时，后肢抓住突出物身体悬在空中；1分：不能悬在空中。斜板实验：大鼠放置在测试面带有浅沟槽的胶皮特制的斜板上，测量大鼠维持姿势的能力、抓握能力和在斜板上至少停留5 s的最大角度并作为其功能值。每只大鼠测量3次，记录分数最高者。正常大鼠在斜板上停留的最大角度为80°。综合得分情况评定大鼠缺血再灌注后24 h时神经缺陷功能。

1.3.45-LOX、p-ERK1/2和t-ERK1/2的mRNA表达水平的检测复制成功脊髓再灌注损伤的模型后24 h测定神经功能，每组缺血再灌注120 min后处死大鼠迅速取出L5～7段脊髓组织，置入液态氮中冻存备用。将其组织于RNA iso plus中研磨，氯仿抽提、75%乙醇沉淀组织内RNA，定量后反转录成cDNA。加入针对不同目标基因片段的引物，暗室内上样后进行实时荧光定量PCR，分析曲线并作统计分析。以目标基因吸光度值与β-actin吸光度值的比值反映5-LOX、p-ERK1/2和t-ERK1/2的mRNA表达。

1.3.5Western blot法测定5-LOX、p-ERK1/2和t-ERK1/2蛋白的表达复制成功脊髓再灌注损伤的模型后24 h测定神经功能，每组缺血再灌注120 min后处死大鼠迅速取出L5～7段脊髓组织，依照说明书提取蛋白并测定其浓度。加预冷蛋白提取液稀释于-70℃冰箱保存。相应浓度和等量的样品蛋白经SDS-PAGE电泳后转膜，按次序加入相应的一抗及二抗进行免疫性反应，DAB染色反应，膜晾干后拍照，蛋白条带密度的定量分析运用凝胶图像Image J软件分析目标蛋白条带灰度值，以其与内参GAPDH灰度值的比值反映各物质的表达水平。

1.3.6肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）的检测应用ELISA检测3组血清中TNF-α的含量，操作步骤严格按试剂盒说明书进行。

1.4统计学方法

2 结果

与S组比较，I/R组5-LOX和p-ERK1/2蛋白及其mRNA表达上调，且NDS评分及血清TNF-α水平升高，I组5-LOX mRNA和p-ERK1/2蛋白及其mRNA表达上调（P＜0.05）；与I/R组比较，I组5-LOX和p-ERK1/2蛋白及其mRNA表达下调，且NDS评分及血清TNF-α水平降低（P＜0.05）。见附表和附图。

附表3 组脊髓组织5-LOX、p-ERK1/2、t-ERK1/2和TNF-α的表达及NDS评分的比较（n=45，x±s）

附图 各组5-LOX和p-ERK1/2蛋白的检测

3 讨论

研究证实，缺血再灌注损伤后24 h Beclin 1及LC3蛋白等自噬基因水平高，故本研究以此为研究时点[4]。结果表明，大鼠脊髓缺血再灌注时神经功能缺陷评分升高，表明大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型制备成功。本研究依照文献的方法[9]进行七氟醚预处理，结果表明七氟醚预处理可降低缺血再灌注期间神经功能缺陷评分，表明七氟醚预处理减轻了大鼠脊髓缺血再灌注损伤。

本研究结果显示，大鼠脊髓缺血再灌注期间5-LOX和p-ERK1/2蛋白及其mRNA表达明显上调，七氟醚预处理后其表达明显下调，表明七氟醚预处理可通过下调5-LOX表达，抑制ERK1/2信号通路，从而减轻大鼠脊髓缺血再灌注损伤。

脊髓缺血再灌注时，5-LOX激活蛋白首先活化，进而引起5-LOX表达上调。5-LOX表达上调可诱导p-ERK1/2表达和激活TNF-α，从而激活ERK1/2信号通路，释放促炎细胞因子，导致炎性级联反应，从而诱发脊髓损伤[10-11]。七氟醚下调5-LOX表达的具体机制尚待进一步研究。

综上所述，七氟醚预处理可能通过下调5-LOX表达，抑制ERK1/2信号通路，从而减轻大鼠脊髓缺血再灌注损伤。

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（张立芳 编辑）

Effect of sevoflurane preconditioning on expression of 5-lipoxygenase during spinal cord ischemia-reperfusion in rats*

Jun OU1,Hong ZHAO1,Hong XIE1,Xiao-tao SU1,Jun HE1,Jun HE1
(1.Department of Spinal Surgery,Nanhua Hospital Affiliated to University of South China,Hengyang, Hunan 421002,P.R.China;2.Teaching and Research Office of Basic Nursing,the School of Nursing,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,P.R.China)

【Objective】To investigate the effect of sevoflurane preconditioning on the expression of 5-lipoxygenase(5-LOX)during spinal cord ischemia-reperfusion(I/R)in rats.【Methods】Forty-five male adult Sprague-Dawley rats weighing 250～300g were randomly divided into 3 groups(n=15 each):sham operation group (group S);spinal cord I/R group(group I/R);sevoflurane preconditioning group(group I).The animals were anesthetized with intraperitoneal 4%chloral hydrate 0.1 mg/kg.Spinal cord ischemia was induced by 10 min occlusion of the thoracic aorta combined with controlled hypotension(MAP=40 mmHg).The rats inhaled 3.4% sevoflurane for 2 h and spinal cord I/R was produced 24 h later in group I.The neurological deficits were scored at 24 h of reperfusion.The animals were then sacrificed.The expression of 5-LOX,p-ERK1/2 and t-ERK1/2 protein and mRNA was detected using Western blot and RT-PCR respectively.TNF-α levels in serum were detected by ELISA.【Results】Compared with group S,the neurological deficit score and TNF-α levels in serum were significantly increased in groups I/R and I,the expression of 5-LOX and p-ERK1/2 protein and mRNA was up-regulated in group I/R,and the expression of 5-LOX mRNA and p-ERK1/2 protein and mRNA was up-regulated in group I(P<0.05).Compared with group I/R,the neurological deficit score was significantly lower,TNF-α levels in serum was lower,and the expression of 5-LOX and p-ERK1/2 protein and mRNA was lower in group I(P<0.05).【Conclusion】Sevoflurane preconditioning can reduce spinal cord I/R injury by down-regulating the expression of 5-LOX and inhibiting ERK1/2 signaling pathway in rats.

arachidonate 5-lipoxygenase;sevoflurane;ischemic preconditioning;reperfusion injury;spinal cord

R-332

A

1005-8982（2015）25-0012-04

2015-01-17

湖南省自然科学基金资助项目（No：2013FJ4212）；湖南省教育厅资助项目（No：14B157）