Th17细胞在支气管哮喘小鼠发病机制中的作用研究

单世民，毛毅敏，孙瑜霞

（河南科技大学第一附属医院，河南 洛阳 471000）

·论著·

Th17细胞在支气管哮喘小鼠发病机制中的作用研究

单世民，毛毅敏，孙瑜霞

（河南科技大学第一附属医院，河南 洛阳 471000）

目的研究Th17细胞及其分泌的炎症因子（IL-17）在哮喘小鼠气道炎症中的作用机制，并初步探讨Th17和T-reg细胞的表达失衡的意义。方法将30只小鼠随机分为对照组和模型组，采用卵白蛋白（OVA）致敏的方法建立小鼠哮喘模型。对两组小鼠肺泡灌洗液（BALF）中炎症细胞进行计数，并采用酶联免疫吸附法检测BALF中IL-17和IL-10水平；流式细胞术检测小鼠外周血Th17和T-reg细胞占CD4+T淋巴细胞百分率情况；并分析Th17和T-reg细胞数与BALF中性粒细胞的相关性。结果哮喘组小鼠BALF中细胞总数和中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞百分率均明显高于对照组（P＜0.05）。哮喘小鼠外周血Th17/T-reg细胞比例增大；BALF上清中IL-17水平明显升高，而IL-10水平明显降低（均P＜0.05）。Th17细胞数与BALF中的中性粒细胞数呈正相关，而T-reg细胞数与BALF中的中性粒细胞数呈负相关。结论Th17及其分泌的炎症因子IL-17在哮喘小鼠气道炎症反应中有着重要作用，同时Th17/T-reg细胞在小鼠哮喘模型中失衡表达，提示其参与了哮喘的发病过程，为治疗哮喘提供新的研究思路。

支气管哮喘；Th17；IL-17；T-reg

支气管哮喘是一种常见的慢性肺部疾病，其发病率和死亡率在我国逐年增高，但其发病机制尚不完全清楚。目前认为Th1/Th2细胞失衡导致Th2细胞占优势是哮喘发病最重要的免疫学机制[1]，但近年来的一些实验和临床现象发现，Th1/Th2失衡理论并不能完全解释哮喘的发病过程[2]。最近的研究表明Th17细胞作为一类新发现的辅助性T细胞，它在哮喘的发生及发展过程中具有重要的作用，而CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞（T-reg细胞）亦可能参与了哮喘的发生过程[3]。在Th17细胞分泌的多种细胞因子中，最重要的是白细胞介素-17（interleukin-17，IL-17），而T-reg细胞分泌最常见的细胞因子是白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）[4]。本研究通过观察哮喘小鼠模型中Th17细胞及其分泌的IL-17在小鼠体内的变化情况，初步探讨Th17和T-reg的表达失衡在哮喘小鼠发病机制中的作用，为临床治疗提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1试剂及仪器

卵蛋白（ovalbumin，OVA，美国Sigma公司），ELISA测定试剂盒（深圳晶美生物公司），RPMI 1640培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司，抗小鼠单克隆抗体及其同型对照均购自美国BD/Pharmingen公司，酶标仪（美国PerkinElmer公司），流式细胞仪（美国R&D），光学显微镜（德国Leica公司），超声波雾化器（WH 22000型，广东粤华医疗器械厂有限公司）。

1.2动物分组及小鼠哮喘模型模型建立

实验小鼠为SPF级雌性BALB/c小鼠，6～8周龄，体重18～20 g，随机将30只小鼠分为正常对照组和哮喘模型组，每组各15只。哮喘组于实验开始当天和第8天分别给予腹腔内注射OVA混悬液（含OVA/Al（OH）3为10 mg/g），每次50μg，第16天开始给予雾化吸入含1%OVA的生理盐水40 ml，40 min/d，连续7 d[3]。对照组以等量的生理盐水代替OVA，观察两组小鼠反应和肺功能变化情况。

1.3支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）的收集及制备

两组小鼠在最后1次激发24 h后固定，处死小鼠并打开胸腔对小鼠行气管插管，结扎左侧主支气管，用4℃磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）行支气管肺泡灌洗3次，每次3 ml，回收率在80%以上为合格。对收集液进行离心（4℃，1 000 r/min，5 min）后取上清液，-80℃保存备用。将回收的BALF涂片，HE染色，在光学显微镜下对细胞总数和分类进行计数。

1.4外周血及BALF上清中IL-17和IL-10检测

外周血通过摘眼球获得，离心收集上清，-80℃保存备用。用ELISA检测试剂盒测定外周血和BALF中IL-10和IL-17水平，具体步骤参照试剂盒说明书进行。

1.5流式细胞术检测外周血Th17及细胞

外周血通过摘眼球采取，肝素化处理，加入适当的莫能菌素液，置于50 ml/L二氧化碳CO2、37℃孵育箱培养5 h，加入10μl相应抗体及其相匹配的同型对照，室温避光孵育30 min，PBS洗2次，并用0.5 ml PBS重悬检测，CellQuest软件分析细胞数量情况。

1.6统计学方法

实验结果以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。组间比较分析采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义；相关性分析采用Pearson直线相关分析。

2 结果

2.1肺功能分析

与对照组相比，哮喘模型组小鼠先后出现咳嗽、气急、呼吸频率加快和毛发倒伏等症状，模型组小鼠吸气阻力（inspiratory resistance，Ri）与呼气阻力（expiratory resistance，Re）均明显增加（P＜0.05），肺顺应性下降。见表1。

表1 经OVA激发后两组小鼠气道阻力及肺顺应性比较（[cmH2O·s）/ml±s]

表1 经OVA激发后两组小鼠气道阻力及肺顺应性比较（[cmH2O·s）/ml±s]

注：†与对照组相比，P＜0.05

组别RiReCdyn对照组（n=15）1.8±0.13.5±1.60.16±0.02哮喘组（n=15）3.2±0.2†5.7±0.9†0.11±0.01†

2.2BALF中细胞计数和分类

哮喘组小鼠的BALF中细胞总数和各炎症细胞的百分率均明显高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结果见表2。

2.3Th17细胞和T-reg细胞检测结果

哮喘组小鼠外周血Th17细胞占CD4+T细胞百分比高于对照组，而T-reg细胞占CD4+T细胞百分比低于对照组（均P＜0.05）。哮喘组小鼠存在Th17/T-reg比例失衡，且比值明显高于对照组（P＜0.05）。结果见表3与附图。

附图 对照组与模型组小鼠Th-17细胞和T-reg细胞所占比例（%）

表2 两组小鼠BALF中细胞总数和细胞分类比较（n=15±s）

表2 两组小鼠BALF中细胞总数和细胞分类比较（n=15±s）

注：†与对照组相比，P＜0.05

组别细胞总数/（×105个/ml）嗜酸性细胞/%中性粒细胞/%淋巴细胞/%对照组0.7±0.22.8±1.05.2±1.37.8±2.7哮喘组3.4±0.1†26.3±4.0†31.5±4.0†22.7±4.1†

表3 小鼠外周血TH17及Treg细胞占CD4+细胞的比率（±s）

表3 小鼠外周血TH17及Treg细胞占CD4+细胞的比率（±s）

注：†与对照组相比，P＜0.05

组别Th17细胞/%T-reg细胞/%Th17/T-reg对照组2.8±0.97.9±2.40.5±0.2哮喘组9.2±1.3†2.7±0.6†3.5±0.3†

2.4两组小鼠BALF中IL-17与IL-10水平的检测哮喘组BALF和血清中IL-17水平明显升高，与正常对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）。哮喘组BALF和血清中IL-10水平明显下降，与正常对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表4。

表4 两组小鼠肺泡灌洗液和血清中IL-10和IL-17水平（pg/ml±s）

表4 两组小鼠肺泡灌洗液和血清中IL-10和IL-17水平（pg/ml±s）

注：†与对照组相比，P＜0.01

组别IL-10IL-17 BALF血清BALF血清对照组（n=8）108.1±13.1 131.4±3.55.3±0.35.8±0.8哮喘组（n=8）29.3±12.8†33.2±14.8†11.3±2.4†22.2±3.9†

2.5相关性分析

哮喘组小鼠外周血Th17细胞数与BALF中的中性粒细胞数呈正相关（r=0.421，P＜0.05），T-reg细胞数与BALF中的中性粒细胞数呈负相关（r= -0.533，P＜0.05）。

3 讨论

支气管哮喘是一种与免疫功能紊乱有关的慢性气道炎症性疾病，长期以来，Th1/Th2失衡理论在哮喘发病机制中占主导地位。近年来研究发现，Th17细胞是一种新型的不同于Th1和Th2，独立分化和发育的另一种辅助性T细胞（Th17）亚群，与哮喘密切相关[5]。该细胞由天然T细胞前体Th0分化而来，在促炎症反应和自身免疫性疾病中有着重要作用[6]。该细胞亚群能够特异性地产生效应因子IL-17，而不产生干扰素-γ和IL-4。因此，被称为Th17亚群[7]。Th1和Th2细胞因子能够调控Th17细胞亚群的分化，IL-6和转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）联合作用能诱导初始T细胞分化成Th17细胞[8]，这些机制表明Th17细胞在哮喘的发病中同样具有一定作用。

Th17分泌的IL-17是T细胞诱导的炎症反应的早期启动因素，它是强大的促炎细胞因子，其主要的促炎机制是促进多种细胞（如上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞和基质细胞）释放炎性（如IL-6、IL-8、粒细胞集落刺激因子以及前列腺素E2）而导致炎症反应[9]。T-reg细胞的作用机制主要包括通过分泌细胞因子IL-10和TGF-β直接介导免疫抑制，其中，细胞因子IL-10具有抗炎作用，既可抑制促炎细胞因子的合成，亦可抑制嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞及肥大细胞的致炎，Foxp3是调控T-reg的标志性转录因子[10]。有研究表明，哮喘小鼠外周血中的T-reg细胞显著低于正常小鼠[11]，与本实验结果一致，而本实验结果还显示T-reg细胞所分泌的细胞因子IL-10水平低于正常小鼠。

本研究中，哮喘组小鼠BALF中细胞总数和中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等均明显增高，以及Th17相关细胞因子IL-17的水平亦较正常对照组明显升高，同时哮喘组小鼠外周血Th17细胞占CD4+T细胞的比例较对照组小鼠明显升高，表明Th17及其分泌的炎症因子参与了哮喘的发病过程。IL-17可增强IL-1及肿瘤坏死因子的功能，诱导IL-6及IL-8的产生，增强I-CAM-1在细胞表面的表达。因此，IL-17是T细胞调节中性粒细胞参与哮喘炎症反应的中介；另外IL-17还具有上调黏液基因表达促进黏液分泌的作用，并可间接促进气道组织纤维化而参与哮喘的气道重塑过程。

本实验还发现在哮喘小鼠中Th17细胞比例明显高于正常组小鼠的同时，T-reg细胞比例则明显减少，同时T-reg细胞所分泌的相关细胞因子IL-10也明显降低，从而导致Th17/T-reg失衡，比值明显升高，表明哮喘发生的过程可能与Th17/T-reg失衡导致的免疫紊乱有关。T-reg细胞数量减少、导致炎症反应的功能降低，而Th17细胞过度表达，通过分泌IL-17诱导细胞因子和趋化因子的释放而介导气道炎症，Th17/T-reg失衡这一新的机制有助于寻找新的治疗哮喘的方法。

综上所述，哮喘小鼠Th17细胞通过对哮喘气道炎症产生影响，促进气道内中性粒细胞及嗜酸性粒细胞的聚集，从而在哮喘发病过程中发挥了重要作用，而Th17/T-reg的比例失衡弥补了Th1/Th2介导的效应机制的不足，提示Th17/Treg失衡可能在哮喘的发病机制中具有重要作用。

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（张立芳 编辑）

Roles of Th17 lymphocyte and its inflammatory cytokines in asthmatic mice

Shi-min SHAN,Yi-min MAO,Yu-xia SUN
(Department of Respiratory Medicine,First Affiliated Hospital,Henan University of Science and Technology,Luoyang,Henan 471000,P.R.China)

【Objectives】To investigate the roles of Th17 cell and its inflammatory cytokines in the exacerbation of airway inflammation of murine asthmatic model,and to discuss the influence of imbalance expression of Th17/T-reg in asthmatic mice.【Methods】Thirty mice were randomized into two groups:control group and asthma group. The mice of asthma group were sensitized and challenged with ovalbumin(OVA).The mice of control group were given normal saline alone under the same conditions as the asthma group.We observed the changes of Th17 and T-reg cells in cellular proportion in the bronchoalveolar lavage fluid(BALF)under a light microscope.And we detected the changes of Th17 and T-reg in cellular proportion in peripheral blood by flow cytometry method.The levels of IL-17 and IL-10 were detected by ELISA kits.A correlation analysis was done between Th17,T-reg and neutrophile granulocyte cells in the peripheral blood and neutrophils in BALF.【Results】The total cell number and the percentage of neutrophils,eosinophils and lymphocytes in BALF of the asthma mice were significantly higher than those of the control mice(P<0.05).The level of IL-17 in asthma group was significantly higher than that in the control group(P<0.05),and the level of IL-10 in asthma group was significantly lower than that in the control group(P<0.05).The expression of Th17 was positively correlated with the levels of neutrophils in BALF,and the expression of T-reg was negatively correlated with the levels of neutrophils in BALF.【Conclusion】Th17 cells could induce the asthma airway inflammation.And the imbalance expression of Th17/T-reg could play an important role in asthma pathogenesis.

asthma;Th17;IL-17;T-reg

R562.2；R-332

A

1005-8982（2015）25-0021-04

2014-12-17