C35对胃癌细胞侵袭性的影响*

詹远京，牛立志，徐克成，穆峰，施娟娟

（广州复大肿瘤医院肿瘤科，广东 广州 510305）

·论著·

C35对胃癌细胞侵袭性的影响*

詹远京，牛立志，徐克成，穆峰，施娟娟

（广州复大肿瘤医院肿瘤科，广东 广州 510305）

目的了解C35基因在胃癌细胞株中的表达水平，探讨C35基因在胃癌发生发展中的作用。方法培养人胃癌细胞株SGC-7901、BGC-823、HGC-27及正常人胃黏膜上皮细胞株GES-1，以实时定量PCR检测胃癌细胞株及正常胃黏膜细胞株中C35的表达水平；使用小片断干扰RNA（siRNA）下调胃癌细胞株C35的表达；实时定量PCR及免疫印迹检测干扰前后C35 mRNA及蛋白质表达的变化；MTT法和体外Matrigel侵袭实验观察C35减敲后胃癌细胞株生长能力和侵袭能力的改变。结果C35在胃癌细胞株中呈高表达，而在正常胃黏膜细胞中不表达；经C35特异的siRNA作用后，C35 mRNA及蛋白质表达明显下降；减敲C35后，胃癌细胞株的生长能力和侵袭能力显著降低。结论C35在胃癌细胞株中特异性高表达，C35在胃癌的发生发展中起促进作用。

C35；胃癌；基因干扰

2006年，EVANS等[1]通过扣除杂交技术，发现一种在乳腺癌细胞中普遍存在且特异性高表达，而在正常乳腺组织中不表达的新基因C35。C35基因位于人染色体17q12，在Her-2/neu的扩增子上，位于Her-2/neu和GRB7之间，编码12 kDa的膜固定蛋白。通过免疫组织化学研究发现，60%以上的乳腺癌患者可检测到C35基因在所有癌症发展阶段均存在稳定的过表达现象。DASGUPTA等[2]研究发现，C35蛋白在前列腺癌细胞中可促进癌细胞的迁移和浸润。

胃癌缺乏理想的肿瘤标志基因和分子靶向药物。本研究以人胃癌细胞株SGC-7901、BGC-823及HGC-27为实验组，以正常人胃黏膜上皮细胞株GES-1作为对照，比较胃癌细胞株与正常胃黏膜细胞株之间C35的表达差异，初步探讨C35基因在胃癌发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1材料与试剂

SGC-7901、BGC-823、HGC-27购自中国科学院上海细胞库，GES-1购自上海消化系疾病研究所，RPMI 1640培养基购自GibcoTM公司，标准胎牛血清购自杭州四季青公司，0.25%胰蛋白酶购自Amresco公司，C35特异性siRNA、羊抗人C35抗体、辣根过氧化物酶标记的驴抗羊二抗抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司，Trizol试剂盒、脂质体转染试剂Lipofectamine 2000及逆转录试剂盒购自Invitrogen公司，Real time聚合酶链反应扩增试剂盒购自美国Gene Copoeia公司，噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）试剂盒购自碧云天生物技术研究所，Transwells小室购自COSTAR公司，基底膜基质Matrigel购自Beeton Dickinson公司。

1.2细胞培养

将细胞株置于10 ml含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，在37℃、5%二氧化碳CO2、95%湿度的培养箱中贴壁生长。约3～5 d换液，待细胞长满培养瓶底75%面积时，用0.25%胰酶消化传代。

1.3实时定量PCR

按Trizol说明书中步骤提取各实验细胞株的总RNA，取RNA 1μg按说明书方法逆转录成cDNA用于后续PCR反应。用ABI 7500荧光定量PCR仪和SYBR Green I染料混合物进行PCR反应，反应条件为：93℃预变性1 min，40个循环93℃变性30 s、55℃退火45 s，72℃延伸30 s，然后从72～95℃建立熔解曲线。以ABI 7500 Software v2.0.6读取PCR反应结果。C35为目的基因，正向引物序列：5'-GAGATAAATGGACAGCTGGTGTTCT-3'；反向引物序列：5'-CGGCTGTTGGTGATCTTTTCTA-3'。以GAPDH为内参，正向引物序列：5'-CCTGCACCACC AACTGCTTAG-3'；反向引物序列：5'-CAGTCTTCTG GGTGGCAGTGA-3'。实时定量PCR结果以Ct值表示，△Ct为同一样本中内参与目的基因Ct值之差，采用2-△△Ct相对定量分析方法比较目的基因在实验和对照样品间的表达差异。

1.4siRNA转染

转染前1天将1.0×105对数期生长的细胞接种于24孔培养板中，每孔加入0.5 ml的培养基，以10μmol/L浓度的siRNA进行基因干扰实验。第2天按照LipofectamineTM2000说明书的常规方法配制转染试剂，每孔使用DNA 0.8μg、转染试剂2.0μl，转染3～5 h后换液，继续培养24 h后收集样本，通过实时定量RT-PCR方法检测C35基因的mRNA表达水平。

1.5Western blot

采用化学发光（ECL法）技术进行C35蛋白检测。收集各组细胞后超声破碎，取适量进行12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳；羊抗人C35抗体作为一抗，GAPDH作为对照。

1.6MTT实验

收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，铺板使细胞密度调至103～104个/孔。5%二氧化碳CO2，37℃条件下孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）。转染siRNA后孵育48 h进行MTT检测。

1.7细胞体外浸润实验

取300μl无血清培养基，加入60μl Matrigel混匀，加入上室各100μl（3个室），37℃孵育5 h使其呈凝胶状；上室加入无血清培养基稀释的细胞100μl，下室内加入完全培养基500μl；放入细胞培养箱，在37℃、5%二氧化碳CO2条件下培养24 h；取出小室，吸弃上室液体，用棉签仔细擦净膜上未侵袭的细胞以及人工基底胶膜，PBS洗2遍，5%戊二醛固定，加入结晶紫染色；显微镜下计数浸润到小室背面的细胞，200倍光镜随机选择5个视野计数，取平均值。

1.8统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析，数据以均数±标准差（x±s）表示，两组间均数比较用t检验，两组以上均数比较用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1胃癌细胞株中C35的表达

实时定量PCR检测C35基因在3株胃癌细胞株和正常胃黏膜细胞株中mRNA表达水平。熔解曲线具有单峰特异性，正常胃黏膜细胞株GES-1中未检出C35基因，HGC-27和BGC-823中C35的表达分别是SGC-7901的1.47倍和1.58倍。Western blot检测C35蛋白在4种细胞株中的表达，3种胃癌细胞株均表达，GES-1无明显表达。见图1。

图1 C35在GES-1、HGC-27、BGC-823和SGC-7901细胞株中的表达

2.2siRNA转染后C35的表达

与阴性对照组比较，实时定量PCR结果显示24 h后HGC-27、BGC-823和SGC-7901细胞株中目的基因C35的抑制效率分别为：84.40%、89.20%和93.34%。与空白对照比较，HGC-27、BGC-823及SGC-7901中C35的表达水平分别是：0.007480、0.010315和0.004432。ECL方法显示siRNA转染24 h后C35的蛋白表达明显受抑制。见图2和3。

图2 siRNA基因减敲后C35在GES-1和HGC-27的表达

图3 siRNA基因减敲后C35在BGC-823和SGC-7901的表达

2.3siRNA转染后胃癌细胞株的增殖水平

MTT检测显示，siRNA转染48 h后，胃癌细胞株HGC-27、BGC-823和SGC-7901在酶标仪490 nm处测量吸光光度值分别为：（0.325±0.011）、（0.235±0.019）和（0.330±0.034），方差分析结果显示每种胃癌细胞株siRNA干扰组、未受干扰组、阴性对照组之间差异有统计学意义（均P＜0.001），LSD法结果显示3种胃癌细胞株siRNA干扰组吸光光度值均显著小于其他两组（均P＜0.001），siRNA转染后胃癌细胞株的增殖能力明显降低。见图4。

图4 siRNA基因减敲后细胞株的增殖水平

2.4siRNA转染后胃癌细胞株的侵袭能力

HGC-27细胞株siRNA转染组细胞穿过人工基底膜的平均细胞数为（13.0±2.3）个，显著少于阴性对照组（53.0±7.8）个（t检验，P＜0.001）及空白对照组的（58.0±10.7）个（P＜0.001）；BGC-823细胞株siRNA转染组细胞穿过人工基底膜的平均细胞数为（5.0±1.8）个，显著少于阴性对照组（45.0±8.1）个（P＜0.001）及空白对照组的（49.0±7.3）个（P＜0.001）；SGC-7901细胞株siRNA转染组细胞穿过人工基底膜的平均细胞数为（5.0±2.0）个，显著少于阴性对照组（13.0±2.6）个（P＜0.001）及空白对照组的（15.0± 2.7）个（P＜0.001）。

3 讨论

以往研究证实[3-4]，20%～40%乳腺癌患者存在Her-2/neu过度表达。有研究通过免疫组织化学研究发现，60%以上的乳腺癌患者可检测到C35基因在所有癌症发展阶段均存在稳定的过表达现象，表达量和稳定性均明显高于Her-2/neu基因。所有Her-2/ neu基因高表达的病例均有C35基因高表达，但尚未检测到Her-2/neu基因表达阳性而C35基因表达阴性的乳腺癌病例，表明C35基因在乳腺癌细胞的过表达更常见、范围更广，其功能可能与乳腺癌的发生、发展关系更为密切。巴再华等[5]研究发现随着乳腺癌组织的TNM分期、病理组织学分级的增加，C35蛋白阳性率显著升高。C35被认为是一种新型乳腺癌标志基因，尤其适用于乳腺癌早期阶段的预测和诊疗。

胃癌中也存在Her-2/neu的过度表达。采用单克隆抗体的ICH法检测Her-2/neu表达的研究表明，胃癌中Her-2/neu的过表达率为6%～45%，BANG等[6]在大样本量的一个研究（3 883例胃癌患者）中得到Her-2/neu的过表达率为22.9%。胃癌的基础和临床研究显示，Her-2/neu在部分胃癌患者中过表达，是一个预后不良因素，曲妥珠单抗作为针对Her-2/neu的分子靶向药物，将其联合化疗可改善总生存率，取得了较好的疗效[7]。通过靶向药物抑制Her-2/neu基因过度表达来治疗胃癌的局限性在于：Her-2/neu过表达在胃癌患者中所占比例有限，且即使是Her-2/neu过表达患者，仍有超过50%患者未获治疗反应[8]。

本研究以胃癌细胞HGC-27、BGC-823、SGC-7901及正常胃黏膜细胞GES-1为对象，结果表明C35在分化程度不同的胃癌细胞株中均呈高表达水平，而在正常胃黏膜细胞中不表达，初步证实C35可能是理想的胃癌细胞诊断的标志分子。将C35特异的siRNA经脂质体转染至胃癌细胞后，C35的抑制率较高蛋白表达明显受抑制，癌细胞的侵袭能力显著下降，表明C35可成为理想的胃癌治疗靶基因。

C35蛋白的致癌性与ITAM motif（一种在逆转录病毒中发现的结构域）[9]存在直接关联。KATZ等[10]发现，C35基因在正常细胞中处于失活状态，过表达后会通过上皮细胞转化为间叶细胞的细胞转化过程，下调上皮细胞标志基因E-cadherin和keratin-8的表达，细胞形态趋向纺锤型，最终导致细胞癌变。HSU等[11]通过研究C35蛋白的空间结构，提出C35可能依靠具有氧化还原活性的超二级结构而在AKT磷酸化过程中发挥重要的调节作用。随着机制研究的不断深入和靶向药物的加速研发，相信C35会为胃癌的诊断与治疗产生巨大推动作用。

[1]EVANS EE,HENN A D,JONASON A,et al.C35(C17orf37)is a novel tumor biomarker abundantly expressed in breast cancer [J].Mol Cancer Ther,2006,5(11):2919-2930.

[2]DASGUPTA S,WASSON LM,RAUNIYAR N,et al.Novel gene C17 or f37 in 17q12 amplicon promotes migration and invasion of prostate cancer cells[J].Oncogene,2009,28(32):2860-2872.

[3]KAUFMANN M,VON MINCKWITZ G,BEAR HD,et al.Recommendations from an international expert panel on the use of neoadjuvant(primary)systemic treatment of operable breast cancer:newper-spectives2006[J].AnnOncol,2007,18(12): 1927-1934.

[4]WOLFF AC,HAMMOND ME,SCHWARTZ JN,et al.American SocietyofClinicalOncology/CollegeofAmericanPathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer[J].J Clin Oncol,2007,131(1): 18-43.

[5]巴再华,朱嵩,徐超,等.C35蛋白在乳腺癌组织中的表达及临床意义[J].中国病原生物学杂志,2013,8(6):551-555.

[6]BANG Y,CHUNG H,XU J,et al.Pathological features of advanced gastric cancer(GC):relationship to human epidermal growth factor receptor2(HER2)positivity in the global screening programme of the ToGA trial[J].Journal of Clinical Oncology, 2009,27(15S):4556.

[7]NICHOLAS G,CRIPPS C,AU HJ,et al.Early results of a trial oftrastuzumab,cisplatinanddocetaxelforthetreatmentof metastatic gastric cancer overexpressing HER2[C].Istanbul:ESMO,2006.

[8]VALABREGA G,MONTEMURRO F,AGLIETTA M.Trastuzumab:mechanism of action,resistance and future perspectives in HER2-overexpressing breast cancer[J].Ann Oncol,2007,18(6): 977-984.

[9]UNDERHILL D M,GOOD RIDGE HS.The many faces of ITAMs [J].Trends Immunol,2007,28(2):66-73.

[10]KATZ E,DUBOIS-MARSHALL S,SIMS AH,et al.A gene on the HER2 amplicon,C35,is an oncogene in breast cancer whose actions are prevented by inhibition of syk[J].British Journal of Cancer,2010,103(3):401-410.

[11]HSU CH,SHEN TL,CHANG CF,et al.Solution structure of the oncogenic MIEN1 protein reveals a thioredoxin-like fold with a redox-active motif[J].PLoS One,2012,7(12):e52292.

（张立芳 编辑）

Effect of C35 on invasion of gastric cancer cell lines*

Yuan-jing ZHAN,Li-zhi NIU,Ke-cheng XU,Feng MU,Juan-juan SHI
(Department of Oncology,Fuda Cancer Hospital at Guangzhou, Guangzhou,Guangdong 510305,P.R.China)

【Objective】To investigate the expression of C35 in gastric cancer cell lines,and the effect of C35 on carcinogenesis and development of gastric cancer.【Methods】Human gastric cancer cell lines,including SGC-7901,BGC-823,HGC-27,and human gastric epithelial cell line GES-1,were cultured.The expression of C35 in gastric cancer cells and human gastric epithelial cells were detected by real-time PCR.We perturbed C35 gene expression using short interfering RNA molecules(siRNAs)and then investigated the changes of C35 gene expression before and after the interference using Western blots and RT-PCR.The proliferative and invasive abilities were detected by MTT colorimetry and Matrigel invasion assays.【Results】C35 was positively expressed in gastric cancer cell lines,while negatively expressed in normal gastric epithelial cells.After gene transfection,the expression level of C35 decreased notably.The proliferative and invasive abilities were obviously inhibited in gastric cancer cells in which C35 gene had been"knocked out".【Conclusion】C35 can over express in human gastric cancer cell lines and enhance the growth ability of gastric cancer cells.

C35;gastric cancer;RNA interference

R735.7

A

1005-8982（2015）25-0008-04

2015-01-18

中国科学院再生生物学重点实验室开放课题（No：KLRB201219）