雷帕霉素联合顺铂对卵巢癌SKOV-3细胞株三磷酸腺苷含量以及新生血管生成的影响

邓中华

（江西省吉安市中心人民医院药剂科，江西 吉安 343000）

·论著·

雷帕霉素联合顺铂对卵巢癌SKOV-3细胞株三磷酸腺苷含量以及新生血管生成的影响

邓中华

（江西省吉安市中心人民医院药剂科，江西 吉安 343000）

目的研究雷帕霉素联合顺铂对卵巢癌SKOV-3细胞株三磷酸腺苷（ATP）以及新生血管生成的影响。方法培养卵巢癌SKOV-3细胞株，分为空白对照组（不含胎牛血清和药物的培养基处理）、顺铂组（10μmol/L顺铂处理）、雷帕霉素组（40 nmol/L雷帕霉素处理）、联合用药组（10μmol/L顺铂+40 nmol/L雷帕霉素处理），检测细胞活力、ATP生成量以及上清液中血管内皮生长因子（VEGF）含量。结果顺铂组、雷帕霉素组和联合用药组的MTT值、ATP含量以及VEGF含量均低于空白对照组，且联合用药组的MTT值、ATP含量以及VEGF含量低于顺铂组和雷帕霉素组。结论雷帕霉素和顺铂能够抑制卵巢癌SKOV-3细胞株ATP以及新生血管的生成，且两种药物联合应用时具有协同作用。

卵巢癌；雷帕霉素；顺铂；三磷酸腺苷；血管内皮生长因子

卵巢癌是一类对化疗较为敏感的恶性肿瘤，临床上多采用以顺铂为基础的化疗方案来进行治疗。但是，仍有部分患者会在化疗后出现耐药或复发，这也是造成治疗失败以及预后不良的主要原因。mTOR是一类在细胞增殖、细胞周期、细胞迁移等过程中发挥重要调控的分子，雷帕霉素是mTOR特异性的抑制剂，对恶性肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭的生物学行为具有抑制作用，而这一恶性生物学行为又依赖于三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）所提供的能量以及新生血管形成所提供的氧气和能量物质。本研究从ATP及新生血管生成的角度分析了雷帕霉素联合顺铂对卵巢癌SKOV-3细胞株ATP以及新生血管生成的影响。

1 材料与方法

1.1材料

卵巢癌SKOV-3细胞株由中科院细胞库提供；细胞培养用的DMEM/F12培养基及胎牛血清由Gbico公司提供，噻唑蓝（MTT）检测试剂由Promega公司提供，ATP检测试剂由碧云天公司提供；酶联免疫吸附试剂盒由上海邦奕公式提供，雷帕霉素及顺铂等药物均由Cayman公司提供，常规耗材购买于Nest生物公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养方法冻存在液氮罐中的细胞取出后复苏，在15 cm2的培养瓶中培养，待细胞处于对数生长期且铺满培养瓶底面70%～80%时进行传代，分别接种于培养瓶和培养板中。培养瓶中的细胞用于继续传代，培养板中的细胞用于加药处理。

1.2.2细胞处理方法当培养板中的细胞铺满50%～60%时，用不含胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的培养基处理细胞24 h，使其生长同步化，而后分别用不含FBS和药物的培养基（空白对照组）、10μmol/L顺铂（顺铂组）、40 nmol/L雷帕霉素（雷帕霉素组）、10μmol/L顺铂+40 nmol/L雷帕霉素（联合用药组）处理。24 h后收集细胞上清液检测血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF），收集细胞检测MTT和ATP。

1.2.3MTT检测采用promega公司的MTS试剂盒检测MTT值，药物处理24 h后直接在细胞培养孔中加入MTS检测试剂200μl，在孵箱中孵育3～4 h，待检测试剂变色后在酶标仪上读取490 nm处的吸光值作为MTT值，以空白对照组的MTT值为100，计算顺铂组、雷帕霉素组、联合用药组的MTT相对值。

1.2.4ATP检测采用碧云天公司的ATP检测试剂盒（产品编号S0026）检测细胞中ATP的含量，同时采用BCA法测定同一细胞孔中细胞内总蛋白含量，计算每毫克细胞总蛋白中ATP的含量，并以此来反应不同处理组间的ATP含量。

1.2.5VEGF检测采用上海邦奕公式的酶联免疫吸附试剂盒VEGFA（DRE11354）、VEGFB（DRE10433）、VEGFC（DRE10430）检测细胞上清液中VEGF不同亚型的含量。

1.3统计学方法

本研究所有数据均采用SPSS19.0软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（x±s），组间分析采用方差分析，两两比较采用LSD法，以P＜0.05判断差异有统计学意义。

2 结果

2.1MTT检测结果

顺铂组、雷帕霉素组、联合用药组的MTT值分别为（42.5±8.4）、（45.2±7.2）和（19.4±4.7），均低于空白对照组的（100±17.3），差异有统计学意义（P＜0.05），且联合用药组的MTT值低于顺铂组和雷帕霉素组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 不同处理组SKOV-3细胞株的MTT检测结果

2.2ATP检测结果

顺铂组、雷帕霉素组、联合用药组的ATP含量分别为（73.2±11.1）、（69.5±9.5）和（25.4±4.6）nmol/mg，均低于空白对照组的（167.3±23.2）nmol/mg，差异有统计学意义（P＜0.05），且联合用药组的ATP含量低于顺铂组和雷帕霉素组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

2.3VEGF检测结果

经方差分析，4组间VEGF的含量差异有统计学意义（P＜0.05），且顺铂组、雷帕霉素组和联合用药组的VEGFA、VEGFB及VEGFC含量低于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），联合用药组的VEGFA、VEGFB及VEGFC含量低于顺铂组和雷帕霉素组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见附表。

图2 不同处理组SKOV-3细胞株的ATP含量

附表4 组细胞上清液中VEGF含量比较（ng/mg±s）

附表4 组细胞上清液中VEGF含量比较（ng/mg±s）

注：1）与空白对照组比较，P＜0.05；2）联合用药组与顺铂组和雷帕霉素组比较，P＜0.05

组别VEGFAVEGFBVEGFC空白对照组76.8±9.5169.2±30.1200.4±33.7顺铂组34.5±6.41）103.7±18.51）94.2±11.41）雷帕霉素组联合用药组40.8±7.11）19.3±2.81）2）110.4±16.21）48.2±7.51）2）104.5±15.91）39.4±6.51）2）F值26.2419.4924.25 P值0.0010.0010.001

3 讨论

卵巢癌是生殖系统高发的恶性肿瘤，临床上多采用顺铂为基础的化疗方案来处理卵巢癌，尽管卵巢癌细胞对顺铂较为敏感，但耐药和复发仍成为治疗失败的最重要原因[1]。因此，探寻不同作用靶点的药物在卵巢癌的治疗中具有现实的应用价值。mTOR由2549个氨基酸组成，属于非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可以整合能量代谢、氨基酸代谢、葡萄糖代谢以及生长因子所激发的各种信号通路，进而参与细胞增殖、细胞周期、细胞迁移等过程的调控，并且与cyclin D及c-myc等原癌基因的激活密切相关[3]。VAN DER BILT AR[4]的体外研究结果显示，采用小RNA干扰的技术靶向抑制PI3K/AKT介导的mTOR信号通路不仅能够显著抑制细胞的增殖过程，还能发挥强烈的抗血管新生作用。

近年来，越来越多的研究认识到mTOR表达异常在恶性肿瘤发生过程中发挥了至关重要的作用，张斌等[5]的研究发现，卵巢上皮癌组织中磷酸化mTOR的阳性率高达53.9%，而在正常卵巢组织和良性卵巢上皮肿瘤组织中磷酸化mTOR均为阴性。HIRASAWA等[6]的体外实验也发现，mTOR的过度激活会增强卵巢癌细胞株的恶性生物学行为，包括增殖、迁移以及侵袭。因此，抑制mTOR的激活也成为了治疗卵巢癌最具前景的治疗靶点。雷帕霉素的主要作用靶点是mTOR受体，属于mTOR信号通路的拮抗剂[7]，能够通过与FK506结合蛋白在空间上相互靠近并抑制下游蛋白S6K1、4E-BP1发生磷酸化，进而抑制下游相关基因mRNA转录、蛋白翻译，并最终实现对细胞周期的负性调控[8]。

目前，国内外已有关于雷帕霉素处理卵巢癌细胞株的体外研究，国内段钊[9]通过体外培养卵巢癌SKOV-3细胞株发现，雷帕霉素联合顺铂处理能够显著抑制细胞的增殖并影响细胞周期，使细胞停滞于G1期而不进入S期；国外SHEPPARD等[10]的研究也发现，雷帕霉素处理可以抑制SKOV-3细胞的迁移和侵袭过程。本研究通过MTT法检测卵巢癌SKOV-3株也同样发现，顺铂和雷帕霉素处理均能抑制细胞增殖，且两种药物联合应用具有协同作用，顺铂联合雷帕霉素处理组的MTT值显著低于单药处理组。这一结果反映出mTOR抑制剂雷帕霉素在抑制卵巢癌恶性生物学行为中的积极价值。

事实上，卵巢癌细胞无限增殖、远处转移的恶性生物学行为的完成主要依靠ATP所提供的能力以及新生血管所提供的氧气和养分。恶性肿瘤细胞向周围组织迁移和侵润是一个主动的耗能过程，需要通过氧化磷酸化产生ATP提供能力，并在基质金属蛋白酶、转化生长因子等细胞因子的辅助下完成对细胞外基质的降解以及向周围组织的移行。肿瘤组织中大量新生血管可以为氧化磷酸化提供充足的氧气以及葡萄糖等物质，而在这一过程中，肿瘤瘤体分泌大量的细胞因子直接参与血管新生的过程，其中VEGF是目前为止已知作用最为明确的一类促血管新生细胞因子。通过检测ATP和VEGF含量可知，顺铂和雷帕霉素处理均能抑制ATP和VEGF的产生，并且两种药物联合应用具有协同作用，顺铂联合雷帕霉素处理组的ATP和VEGF含量均低于单药处理组。

综上所述，雷帕霉素和顺铂能够抑制卵巢癌SKOV-3细胞株ATP以及新生血管的生成，且两种药物联合应用时具有协同作用。

[1]马湘一,范良生,刘荣华,等.卵巢上皮性癌中mTOR信号通路蛋白的表达及其临床意义[J].中国妇幼保健,2011,26(30):4755-4757.

[2]张晟,张霄蓓,张瑾,等.磷脂酰肌醇3-激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂在乳腺癌治疗中的研究进展[J].中国全科医生,2012, 15(8C):2749-2754.

[3]韩璐,翟晶.雷帕霉素对人宫颈癌Hela细胞增殖和HIF-1及VEGF表达的影响[J].肿瘤防治研究,2013,40(3):245-248.

[4]VAN DER BILT AR,TERWISSCHA VAN SCHELTINGA AG, TIMMER-BOSSCHA H,et al.Measurement of tumor VEGF-A levels with 89Zr-bevacizumab PET as an early biomarker for the antiangiogenic effect of everolimus treatment in an ovarian cancer xenograft model[J].Clin Cancer Res,2012,18(22):6306-6014

[5]张斌,侯志勇,韦励,等.卵巢上皮癌组织中p-mTOR的表达及意义[J].中国妇幼保健,2012,27(5):737-740.

[6]HIRASAWA T,MIYAZAWA M,YASUDA M,et al.Alterations of hypoxia-induced factor signaling pathway due to mammalian target of rapamycin(mTOR)suppression in ovarian clear cell adenocarcinoma:in vivo and in vitro explorations for clinical trial [J].Int J Gynecol Cancer,2013,23(7):1210-1218.

[7]刘奕,杨鸣良,张扬,等.哺乳动物的雷帕霉素靶蛋白及其底物在口腔鳞状细胞癌中的表达[J].华西口腔医学杂志,2004,22(4): 331-333.

[8]FENG X,LI L,JIANG H,et al.Dihydroartemisinin potentiates the anticancer effect of cisplatin via mTOR inhibition in cisplatin-resistant ovarian cancer cells:involvement of apoptosis and autophagy[J].BiochemBiophysResCommun,2014,444(3): 376-381.

[9]段钊,杨雪梅,邢兰瑛,等.雷帕霉素联合顺铂对卵巢癌SKOV-3细胞增殖的抑制作用[J].西安交通大学学报(医学版),2010,31(4): 493-496.

[10]SHEPPARD KE,CULLINANE C,HANNAN KM,et al.Synergistic inhibition of ovarian cancer cell growth by combining selective PI3K/mTOR and RAS/ERK pathway inhibitors[J].Eur J Cancer,2013,49(18):3936-3944.

（王荣兵 编辑）

Effect of rapamycin combined with cisplatin on ATP production and angiogenesis in human ovarian cancer SKOV-3 cell line

Zhong-hua DENG
(Department of Pharmacy,the Central People's Hospital of Ji'an City,Ji'an, Jiangxi 343000,P.R.China)

【Objective】To study the effect of rapamycin combined with cisplatin on adenosine triphosphate(ATP) production and angiogenesis in human ovarian cancer SKOV-3 cell line.【Methods】Human ovarian cancer SKOV-3 cell line were cultured and divided into blank control group(treated with medium without FBS and drug),cisplatin group(treated with 10 μmol/L cisplatin),rapamycin group(treated with 40 nmol/L rapamycin),combination group (treated with 10 μmol/L cisplatin combined with 40 nmol/L rapamycin).Then cell viability,ATP production and vascular endothelial growth factor(VEGF)content in supernant were detected.【Results】MTT value,ATP content and VEGF content of cisplatin group,rapamycin group and combination group were lower than those of blank control group.MTT value,ATP content and VEGF content of combination group were lower than those of cisplatin group and rapamycin group.【Conclusion】Rapamycin and cisplatin can inhibite ATP production and angiogenesis in human ovarian cancer SKOV-3 cell line,and combined use of two drugs has a synergistic effect.

ovarian cancer;rapamycin;cisplatin;adenosine triphosphate;vascular endothelial growth factor

R737.31

A

1005-8982（2015）25-0034-04

2015-04-10