参七消痞丸有效成分提取工艺研究＊

2015-12-06童志远牟泽东冉晓辉颜晓燕

成都医学院学报 2015年5期

童志远，牟泽东，冉晓辉，颜晓燕△

1.成都医学院第一附属医院药剂科（成都 610513）；2.成都医学院药学院（成都 610083）；3.四川泰华堂制药有限公司（广汉 618300）

乳腺小叶增生是一种既非炎症亦非肿瘤的慢性疾病，占乳房疾病的70%左右，多见于30～50岁的女性，发病率为20%～30%，部分地区甚至高达50%，癌变率为12.9%～21.9%［1］。参七消痞丸为成都医学院第一附属医院自制制剂，具有多年的临床应用基础，其治疗乳腺小叶增生效果显著，无明显不良反应，患者反馈好。该方主要由人参、三七、柴胡等9味药材组成。目前，该药剂型为大蜜丸，生产工艺较粗糙，质控标准不高，生产效率低，单剂量规格太大，病人服用不便，同时，由于大蜜丸制剂过程中加入了蜂蜜等辅料，糖尿病患者用药受到限制。基于以上不足，本实验通过对参七消痞丸有效成分提取工艺进行初步探索，以期为后期更改剂型奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

试剂材料：柴胡、人参、三七等药材（购于四川新荷花中药饮片股份有限公司）；柴胡皂苷d对照品（购于成都曼斯特生物科技有限公司，生产批号MUST－14031208，纯度≥98%）；甲醇（购于成都科龙化工试剂厂，生产批号2014040101），正丁醇（购于成都科龙化工试剂厂，生产批号2014040101），磷酸（购于成都科龙化工试剂厂，生产批号2014121101），对二甲氨基苯甲醛（购于天津市大茂化学试剂厂，生产批号20141120）。主要仪器：挥发油提取测定器（轻油），BUCHI旋转蒸发仪R－210（瑞士步琦有限公司），ZDHW－调温电热套（北京中兴伟业仪器有限公司），YP2001N电子天平（上海精密科学仪器有限公司），紫外可见分光光度计（Alpha－1900S）。

1.2 方法

1.2.1 水蒸气蒸馏法提取挥发油本方中柴胡、郁金、莪术、香附等均含挥发油成分，可能是适应本症的有效成分。因此，在水提取工艺条件筛选前，先对其挥发油提取工艺条件进行摸索［2－5］。根据处方量称取药材170g，剪为直径约0.5cm的碎块。选取挥发油提取时间和加水倍量（3、4、5倍）为考察因素，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，筛选参七消痞丸中挥发油提取的最佳工艺条件。从冷凝回流开始计时，每小时读取1次挥发油体积，直至挥发油体积不再增加为止，平行实验3次以上。每次实验以挥发油最终体积为100%，每次所读取的体积按其在终体积中所占百分比表示。

1.2.2 正交实验法筛选最佳水提取工艺条件立足传统中医理论中“君臣佐使”的理念对方中各药所起的功效及在方中的地位进行分析，初步确定柴胡在本方中占有非常重要的地位。柴胡皂苷是柴胡的主要活性成分，同时也是柴胡中最重要的一类有效成分，主要含柴胡皂苷（saikosapoins a、b、c、d 4种），其中以a及d活性最强［6－7］。以柴胡皂苷d为检测指标可间接反映柴胡总皂苷含量［8］。实验最终选择出膏率、柴胡总皂苷提取率和柴胡总皂苷含量作为主要的检测指标并选取第1次煎煮加水倍量（3、4、5倍）、第2次煎煮加水倍量（6、8、10倍）、第3次煎煮时间（1、1.5、2h）为考察因素，通过正交实验对提取挥发油以后的药渣进一步进行水提取，筛选柴胡、郁金等7味药材共煎的最佳水提取工艺条件（表1）。将提取挥发油后的药渣过滤，收集煎煮液，药渣依据L9（34）正交实验表，按不同实验水平下的加水倍量和煎煮时间，分别进行煎煮，最终收集煎煮液备用。

表1 L9（34）正交实验因素水平

1.2.3 不同实验水平下出膏率和柴胡总皂苷提取率合并每个实验水平下的煎煮液，充分摇匀，量取总体积1/2的煎煮液置于恒重的圆底烧瓶中，挥干水分，于60℃烘箱内干燥至连续两次称量质量差小于0.3mg，连续称量3次结果取平均值。用重量差法求出干膏质量，由投料量求得出膏率。

另取剩余体积1/2的煎煮液用饱和正丁醇按1∶1比例连续萃取2次，每次1h，分离合并正丁醇萃取液置于恒重的圆底烧瓶中，挥干正丁醇，干燥至恒重。根据重量差法即得柴胡总皂苷质量，进而求得柴胡总皂苷提取率［9－10］。

1.2.4 紫外分光光度法测定柴胡总皂苷含量 1）标准曲线的制备：精密称取柴胡皂苷d对照品10.32mg，适量甲醇溶解，转移至5mL容量瓶中，加甲醇定容。精密吸取柴胡皂苷d对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于具塞试管中，甲醇分别定量至1.0mL。分别精密加入1%的对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液1.0mL，摇匀，在70℃水浴条件下反应10min，取出放冷。分别精密加入磷酸5.0mL，摇匀，在70℃水浴条件下反应30min，取出放冷，于536nm处测定吸光度［11］。绘制标准曲线，求出回归方程：Y＝0.0006X－0.0645，R＝0.999。表明柴胡皂苷在（206.4～2064.0）mg/L范围内成良好的线性关系。2）精密度实验：精密吸取对照品溶液0.6mL，共5份，置具塞试管中，加甲醇至1.0mL，其余操作同“标准曲线的制备”，于536nm处测定吸收度。结果对照品的RSD为0.09%。3）稳定性实验：取精密度项下的第5号样品于10、20、30、60、90、120min测定吸收度，RSD为6.25%，对照品溶液在显色后20min内基本稳定。4）重复性实验：对同一样品，平行取6份供试品溶液进行含量测定，结果平均含量为10.19mg/g，RSD为2.11%。5）加样回收实验：取已知含量的同一样品9份，精密称定，分别精密加入相同量的对照品溶液，其余操作同“标准曲线的制备”。于536nm处测定吸收度，计算回收率。平均回收率为99.06%，RSD 为0.96%（表2）。6）样品含量测定：用适量甲醇将柴胡总皂苷样品溶解，转移至5mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。分别精密吸取0.4mL供试品溶液置于具塞试管中，加甲醇至1mL。其余操作同“标准曲线的制备”，反应后放冷，分别加入适量甲醇调节各供试品溶液浓度，使其在536nm处吸光度在0.2～0.8之间，每个样品平行测定3次，取平均值，根据标准曲线求得每个样品中柴胡总皂苷的百分含量［12－14］。

表2 加样回收率实验

2 结果

2.1 挥发油提取工艺筛选结果

实验采用水蒸气蒸馏法对参七消痞丸处方中挥发油提取条件进行摸索，结果显示提取时间达6h后，挥发油量基本不再增加，且提取挥发油的加水倍量对挥发油提取影响不大（表3）。

表3 不同时间出油量及出油率

2.2 正交实验法筛选最佳水提取工艺条件结果

分别选取出膏率、柴胡总皂苷提取率及柴胡总皂苷含量中的最大值设定为100%，其余结果分别按其所占百分比表示。根据各考察指标的重要程度，取出膏率的权ω1＝0.3；柴胡总皂苷提取率的权ω2＝0.4；柴胡总皂苷含量的权ω3＝0.3。按公式：实验得分＝∑i（ωi×第i个指标）得各号实验的综合得分（表4）。因素水平中最大的综合平均值与最小的综合平均值之差称为因素的极差，极差的大小反映了因素对指标的影响程度，用R表示。由综合平均值的大小选取各因素的最佳水平组合，综合平均值越大，水平越优，各因素最优水平组合在一起即为最佳实验方案。利用综合得分值计算各因素的综合平均值和极差。第1次煎煮加水倍量、第2次煎煮时间、第2次煎煮加水倍量3个因素的极差分别为0.049、0.229、0.179。说明这3个因素对总指标的影响次序为：第2次煎煮时间＞第2次煎煮加水倍量＞第1次煎煮加水倍量。3个因素水平综合平均值的最大值分别为iii＝0.738、ii＝0.822、iii＝0.807（表5）。表明各因素水平的较优搭配为3～2～3，即第1次煎煮加水倍量为5倍、第2次煎煮时间为1.5h、第2次煎煮加水倍量为10倍。

为验证正交实验考察得到的最佳提取工艺组合的合理性和可靠性，在3～2～3条件下重复实验3次，其平均出膏率、平均柴胡总皂苷提取率、平均柴胡总皂苷含量分别为31.63%、4.02%、1.57%，综合评分结果为0.97，表明该提取工艺组合效果较好，并且3次实验结果较稳定，说明该工艺组合可靠（表6）。

表5 综合评分分析结果

表6 验证实验结果

3 讨论

现代医学认为乳腺小叶增生主要是卵巢功能失衡，黄体酮分泌低下，雌激素分泌过高，促使乳腺增生增殖.逐步累积而发病。中医学认为本病属“乳癖”范畴，明代陈氏在《外科正宗》中指出：“乳癖及乳中结核，形如丸卵，或堕作痛或不痛，皮色不变，其核随喜怒消长，多由思虑伤脾，怒恼伤肝，郁结而成也”。祖国医学认为，乳房乃肝经所布之处，七情内伤，肝气郁结则气滞血瘀，肝旺乘脾，脾失健运，聚湿生痰，痰气互结，瘀阻乳络而致乳癖。对于乳腺增生病的治疗，西医多采用3～6个月随访1次的方法，动态观察病情，或用激素类药进行治疗，必要时行手术治疗。中医治疗则主张针对疾病的发病原因和证型进行辨证论治，治疗以疏肝理气、活血化瘀、祛痰散结为主［15］。

“参七消痞丸”是我院使用多年的中药自制制剂，该方主要由人参、三七、柴胡、香附、郁金等9味药组成，其功能主治为：疏肝理气、活血化瘀。通过多年用于乳腺小叶增生的临床治疗，反馈较好，效果显著且无明显不良反应。原方制剂为大蜜丸剂型，无论在制备技术还是质量控制等方面都存在不少问题。蜜丸由原药粉加蜂蜜直接制成，在体内的吸收不完全，影响药效的充分发挥。随着现代科学技术的发展和临床需要，重要剂型改进取得了飞速发展，由以前的丸、散、膏、丹发展为胶囊剂、浓缩丸、微丸、滴丸、注射剂等。中药改进剂型的意义在于提高疗效，扩大应用范围。中药有效成分提取的常用方法有：浸渍法、煎煮法、回流提取法、超临界流体萃取法、超声波协助溶剂提取法和微波协助溶剂提取法等。本研究综合考虑生产成本和现有生产条件等因素，采用水蒸气蒸馏法提取该方中挥发性成分；同时，选取了可行性较好、生产成本较低、工艺较为简便的水提取法对参七消痞丸中的其他有效成分进行提取。由于本研究旨在初步探究参七消痞丸有效成分提取的较优工艺条件，为后续改剂研究提供参考；因而，仅选取了出膏率、柴胡总皂苷提取率和柴胡总皂苷含量3个较为粗略的指标进行考察。我们在此基础上，后期将对整个提取工艺及改剂过程建立更为详尽的质控标准。此外，拟通过细胞水平及整体动物水平实验来研究其与传统剂型在药效学上的差异，以期为其改剂可行性提供更为可靠的实验依据。

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