脂多糖刺激脐带间充质干细胞上调IL－1Ra分泌的研究＊

李 敏，胡 松，王 兰，范文跃

1.成都医学院 基础医学院（成都 610500）；2.成都医学院 生物医学系（成都 610500）

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是来源于中胚层的多能干细胞，具有自我更新和多向分化能力，可向三胚层细胞分化，如骨细胞、神经元细胞、心肌细胞、脂肪细胞和胰腺细胞等［1－5］。骨髓、脐带、脂肪组织、牙组织、羊水、外周血、和鼻甲［6－12］等机体组织均可分离培养出 MSCs。其中，以骨髓来源的MSCs最具代表性，但其培养到第6代后增殖能力减弱；而脐带华通胶来源的脐带MSCs（umbilical cord MSCs，UC－MSCs）自我更新及增殖能力均很强［13］。MSCs强表达CD13、CD29、CD105和 CD44，弱表达 CD106，不表达 CD14、CD34、CD11a、CD31、CD45与 HLAⅡ抗原，不表达或低表达HLAⅠ抗原。MSCs具有低免疫原性和免疫抑制特性，可抑制T细胞与B细胞增殖［14－15］，抑制树突状细胞与自然杀伤细胞的免疫功能［16－17］。白介素1受体拮抗剂（interleukin－1receptor antagonist，IL－1Ra）是首个被发现天然存在的细胞因子拮抗剂，竞争性结合于IL－1受体后不引起IL－1生物学效应，从而起到抗炎作用［18］。IL－1Ra和MSCs都具有抑制炎症的作用，其共移植可改善临床疾病的治疗效果［19］。Toll样受体（Toll－like Receptors，TLRs）是参与固有免疫的一类重要蛋白质分子，也是连接固有免疫和适应性免疫的桥梁，其能特异识别病原相关分子模式。当微生物突破机体的物理屏障时，TLRs可识别相应的配体来激活机体产生免疫应答。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是TLR4的特异性配体，LPS激活TLR4，可刺激免疫细胞分泌Ⅰ型IFNs和促炎因子，如TNF－α、IL－1β和IL－6。UC－MSCs高表达 TLR4［20］。

为探讨 MSCs的免疫机制，本研究选择UCMSCs，以IL－6为实验的阳性对照［21－22］，采用 LPS激活TLR4，观察UC－MSCs对IL－1Ra分泌的影响，以期更深入地了解UC－MSCs免疫抑制功能与细胞因子分泌的关系。

1 材料与方法

1.1 试剂

胎牛血清（Millipore，USA）；L－DMEM 培养基（HyClone，美国）；LPS（Peprotech，美国）；IL－1Ra和IL－6试剂盒（上海泛科实业有限公司，中国）；胰蛋白酶（上海碧云天生物技术有限公司，中国）；抗人单 克 隆 抗 体 CD14－PE、CD34－FITC、CD29－PE 和CD105－APC及其同型对照（eBiocsience，美国）；引物合成（上海生工生物工程技术服务有限公司，中国）；Trizol细胞裂解液和逆转录试剂盒（Takara，日本），EvaGreen Dye（Bio－Rad，美国）。

1.2 方法

1.2.1 UC－MSCs原代培养 采用组织块法分离培养UC－MSCs：取新鲜脐带（来源于成都医学院第一附属医院产科，均取得产妇同意）置于培养皿中，用PBS冲去脐带外围血块，撕去外膜，拔掉2根动脉，沿静脉剪开，用眼科镊拨离静脉，剩余为华通胶。PBS冲洗掉剩余脐带组织上的血液，将其剪为约2mm2的组织块，装入T75塑料培养瓶内，加入5mL培养基，48h后加入3mL培养基，每3d换液并镜下观察。

1.2.2 流式细胞术检测UC－MSCs表面标志物 取胰蛋白酶消化UC－MSCs，1000rpm离心5min，以5×104个/管分装于1.5mL离心管中，分别加入抗人单克隆抗体 CD14－PE、CD34－FITC、CD29－PE和CD105－APC及其同型对照，流式细胞仪检测。

1.2.3 分组 设立实验组和对照组，分别以1、10、20μg/mL LPS刺激 UC－MSCs为实验组，未刺激UC－MSCs为对照组；采用1ug/mL LPS分别刺激UC－MSCs 3、8、24h为实验组，未刺激UC－MSCs为对照组。

1.2.4 qPCR法检测IL－1Ra和IL－6基因的表达

Trizol细胞裂解液裂解细胞并提取RNA，按照Takara试剂盒说明书逆转录成cDNA。引物信息如下（表1），设置GAPDH为内参基因，采用qPCR法检测IL－1Ra和IL－6的基因表达。10uL qPCR反应体系：cDNA 1μL，Primer 1μL，EvaGreen Dye 5μL，H2O 3μL。反应条件：95℃3min，1个循环；95℃5s，60℃10s（IL－1Ra 57℃），72℃15s，40个循环；72℃60s，1个循环。Bio－Rad qPCR仪检测。

1.2.5 ELISA法检测IL－1Ra和IL－6蛋白质的分泌 收集LPS不同剂量与时间刺激的细胞上清，未刺激的UC－MSCs上清为空白对照组。按照IL－1Ra和IL－6ELISA试剂盒说明书操作，检测各组上清中IL－1Ra和IL－6蛋白质分泌量。酶标仪测定其吸光度值，绘制标准曲线，并计算各样品的浓度值。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 5软件对所有数据进行分析，两两比较采用单因素方差分析Dunnett－t检验，结果以均数±标准差（±s）进行描述，检验水准α设定为0.05。

表1 qPCR引物信息

2 结果

2.1 原代培养及鉴定

采用脐带组织块贴壁法原代培养第7～10天，可见组织边缘有贴壁细胞，呈长梭形（图1）。流式细胞术检测UC－MSCs的标志性表面抗原，结果显示：UC－MSCs表达CD29和CD105，不表达CD14与CD34（图2）。根据其形状与流式细胞术结果，分离培养的细胞符合UC－MSCs的生物学特性。

图1 UC－MSCs原代细胞培养13d（40×）

图2 流式细胞术检测UC－MSCs表面标志物

2.2 LPS激活TLR4对 UC－MSCs分泌IL－1Ra和IL－6的影响

qPCR法及ELISA法检测LPS不同剂量（1、10、20μg/mL）刺激 UC－MSCs 24h后IL－1Ra和IL－6的分泌。1μg/mL和10μg/mL实验组较对照组IL－1Ra基因表达均增加，20μg/mL实验组较对照组IL－1Ra基因表达下降；1μg/mL实验组与对照组比较，IL－1Ra基因表达差异有统计学意义（P＜0.05）（图3A），而10μg/mL实验组与对照组比较，IL－1Ra基因表达差异无统计学意义（P＞0.05）。1μg/mL和10μg/mL实验组较对照组IL－6基因均表达增加，其差异有统计学意义（P＜0.05）（图3B）；20μg/mL实验组IL－6基因较对照组表达下降。1μg/mL和10μg/mL实验组较对照组IL－1Ra蛋白质分泌增加，20μg/mL实验组较对照组IL－1Ra蛋白质分泌下降；1μg/mL实验组与对照组比较，IL－1Ra蛋白质分泌差异有统计学意义（P＜0.01）（图3C）；而10μg/mL实验组与对照组比较，IL－1Ra蛋白质分泌差异无统计学意义（P＞0.05）。LPS 1μg/mL、10μg/mL和20μg/mL实验组较对照组IL－6蛋白质分泌均增加，其差异有统计学意义（P＜0.01）（图3D）。

qPCR法及ELISA法检测LPS在3、8、24h刺激 UC－MSCs后IL－1Ra和IL－6表达为：3h、8h和24h实验组较对照组IL－1Ra基因表达增加，3h、8h实验组与对照组比较IL－1Ra基因表达差异有统计学意义（P＜0.01）（图4A），而24h实验组与对照组比较IL－1Ra基因表达差异无统计学意义（P＞0.05）。3h、8h和24h实验组较对照组IL－6基因表达均增加，3h实验组较对照组比较，IL－6基因表达差异有统计学意义（P＜0.01）（图4B）；8h和24h实验组与对照组比较IL－6基因表达差异无统计学意义（P＞0.05）。3h、8h和24h实验组较对照组IL－1Ra蛋白质分泌增加，24h实验组与对照组比较IL－1Ra蛋白质分泌差异有统计学意义（P＜0.01）（图4C），而3h、8h实验组与对照组比较，IL－1Ra蛋白质分泌差异无统计学意义（P＞0.05）。3h、8h和24h实验组较对照组IL－6蛋白质分泌均增加，其差异有统计学意义（P＜0.01）（图4D）。

图3 LPS不同剂量刺激UC－MSCs后IL－1Ra和IL－6基因与蛋白质水平比较

图4 LPS不同时间刺激UC－MSCs后IL－1Ra和IL－6基因与蛋白质分泌比较

3 讨论

IL－1Ra对很多炎症性疾病起到广谱抗炎作用，且可抑制移植排斥反应的发生与发展［23］，协同MSCs的免疫抑制作用。IL－1Ra与 MSCs联合移植，可显著改善由氨基半乳糖诱导猪急性肝衰竭的肝功能，促进肝组织再生［19］。在大鼠爆发性肝衰竭模型中，IL－1Ra基因转导至羊水来源的MSCs移植于大鼠中，发现其可促进肝细胞再生，缓解爆发性肝衰竭的病情［24］。IL－1Ra与VEGF基因转导至骨髓MSCs，将其与胰腺进行共移植，发现其可改善移植的治疗效果［25］。 炎症环境可增加IL－1Ra的 分泌［26］。研究［27］发现，炎症环境培养的 MSCs分泌的IL－1Ra比常氧环境增加了10倍。IL－1Ra作用发挥与其竞争性结合IL－1受体，阻断IL－1信号级联反应有关。IL－1β是引发肺水肿起主要作用的炎症因子之一［28］，而在LPS诱导的急性肺损伤模型中，MSCs灌注可提高该疾病的生存率，该作用与MSCs分泌IL－1Ra，进而减弱IL－1β诱导的促炎活动有关［29－30］。在本研究结果显示：LPS诱导的炎症环境可刺激UC－MSCs分泌IL－1Ra增多。

目前，在人类体内发现有10种TLRs（TLR1～10），在小鼠身上发现有13种 TLRs（TLR1～13）［31］，均属于IL－1受体超家族成员。MSCs表达功能性TLR4，可促进其分化［1，20］、增殖［32］和 迁移［33］。有研究发现，激活TLR4可增强 MSCs免疫抑制能力，促使MSCs向抗炎型转变。在Sun等［34］采用LPS诱导小鼠急性肺损伤模型中，发现UCMSCs可快速迁移到炎症部位，减轻肺组织损伤和炎症反应，该作用与LPS刺激UC－MSCs增强CD4＋CD25＋FOX P3＋Treg细胞免疫功能和增加抑炎因子IL－10分泌，并下调促炎因子 TNF－α、MIP－2和IFN－γ表达有关。关于激活TLR4对 MSCs免疫抑制能力影响的研究尚存争议。有研究［35－36］报道，激活TLR4使MSCs向促炎表型转变，也有研究［37－38］报道，激活TLR4对 MSCs的免疫抑制能力并没有影响或者使其作用减弱。本研究发现，LPS不同剂量与时间激活TLR4后，UC－MSCs均分泌IL－1Ra，在基因水平上，以1μg/mL刺激 UC－MSCs 3h和8h表达IL－1Ra差异显著；在蛋白质水平上，则以1μg/mL刺激UC－MSCs 24h表达IL－1Ra差异显著。由此表明，激活TLR4增加UC－MSCs对IL－1Ra的分泌，可能会增强或协同UC－MSCs的免疫抑制作用。

综上所述，UC－MSCs免疫作用发挥可能与炎症环境存在的炎症介质有关，LPS激活TLR4，可刺激UC－MSCs分泌IL－1Ra增加，该作用可能与MSCs免疫调节机制有关，可能协同或增强MSCs的免疫抑制作用。但该作用对炎症的负调控，也可能会增加机体对病原体的感染。因而，深入研究MSCs中TLR4的免疫调节机制，对MSCs临床应用的安全性、有效性和长期性是非常有意义的。

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