SYBR Green实时荧光定量PCR法检测人乳腺球蛋白在乳腺癌诊断中的应用＊

孙昌瑞，邓 君，冯 林，洪 华，江咏梅

1.四川大学华西第二医院 检验科（成都 610071）；2.四川省医学科学院·四川省人民医院 检验科（成都 610072）；3.四川省妇幼保健医院 检验科（成都 610000）

乳腺癌发病率较高，且呈不断上升趋势，早期即可发生微转移，因此，乳腺癌相关基因的检测对于早期诊断、防治复发和预后判断等有重要意义。人乳腺球蛋白（human mammaglobin，HMAM）特异性表达于乳腺组织，对乳腺癌具较高诊断价值。目前常用免疫组织化学染色和RT－PCR等对HMAM mRNA进行检测，上述方法存在标本来源困难，灵敏度较低，特异性较差，操作复杂，或需采用强诱变剂等缺点，而SYBR Green实时荧光定量PCR（real time fluorescence quantitative PCR，FQ－PCR）具有高灵敏性、高特异性、高精确性、无污染和可定量等优点。本研究采用SYBR Green FQ－PCR检测HMAM mRNA在外周血循环肿瘤细胞中的表达并分析其病理意义，同时与RT－PCR进行比较，以期为乳腺癌分子标志物的选择及靶向治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

病例组选取2011年1月至2014年6月四川省人民医院门诊和住院部的相关女性患者共371例：良性乳腺疾病91例，年龄28～77岁，其中纤维瘤53例，脂肪瘤38例，并排除患其他肿瘤可能性；乳腺癌193例，年龄31～78岁；其他肿瘤患者87例，年龄32～81岁，其中结肠癌31例、肺癌26例、卵巢癌30例。所有研究对象的确诊均根据病理学诊断结果。乳腺癌患者纳入标准［1］：1）年龄≥18岁；2）可测量、可评价；3）预测寿命≥2个月；4）美国东部肿瘤协作组（eastern cooperative oncology group，ECOG）得分为0～2分；5）无严重衰竭性疾病；6）无第2个部位恶性肿瘤；7）接受了前期的辅助治疗、放射治疗；8）无任何转移性疾病。

对照组随机选择同期健康女性体检者，排除乳腺和卵巢疾病，且无乳腺癌和卵巢癌家族史，共45例，年龄27～75岁。

1.2 仪器和试剂

逆转录、FQ－PCR 体系、β－actin试剂盒和7500 FAST Sequence Detector分析仪（美国ABI公司）；RNA提取、cDNA的合成和PCR扩增试剂（上海生工生物公司）；IMMELITE WANG化学发光仪（天津得普）；全自动生化分析仪（日本奥林巴斯2700）。

1.3 SYBR Green FQ－PCR探针和引物

采用PE公司Primer Express软件设计HMAM探针和引物，序列如下：HMAM引物正向，5′－GAGTTCATAGACGACAATGCC－3′，反向，5′－CCGTAGTTGGTTTCTCACCAT，β－actin－3′引物：正向，5′－CTCTTCCAGCCTTCCTT CCT－3′，反向，5′－AGCACTGTGTTGGCGTACA G－3′，由上海生工生物公司合成。

1.4 SYBR Green FQ－PCR反应

1）取静脉血5mL，1mg/mL EDTA抗凝，弃去上方的1mL，防上皮细胞污染，采用一步法提取细胞总RNA。2）cDNA的合成：逆转录体系20μL：细胞总RNA 1μg，RNasin 20U，引物200ng，5×反应缓冲液4μL，M－MLV反转录酶20U，42℃反应55min。3）PCR：逆 转 录 产 物 5μL，探 针150nmol/L，引物各为400nmol/L，dATP、dCTP和dGTP各200μmol/L，dUTP 400μmol/L，10×缓冲液5μL，Taq DNA 聚合酶1.25U，MgCl25mmol/L，尿嘧啶 N－糖基化酶（UNG）0.5U。在7500FAST Sequence Detector分析仪上测定标准品和标本HMAM和β－actin含量。扩增参数为：50℃，2min；96 ℃，10min；再95 ℃30s，65 ℃1min，42个循环。仪器根据标准曲线自动计算HMAM和β－actin的拷贝数，以 HMAM 和β－actin比值作为HMAM的表达水平。

1.5 阳性判断

应用2－ΔΔCt方法计算目的基因的相对表达量（Ct为循环阈值）。ΔCt值＝目的基因（HMAM）Ct值－β－actin基因 Ct值，以β－actin为对照；ΔΔCt＝乳腺癌组的ΔCt值－健康体检组的ΔCt值，以健康体检组为对照。45例健康人的基因表达相对量为1.003±0.087，2－ΔΔCt值为乳腺癌组基因相对健康体检组基因表达的倍数，测定值以2－ΔΔCt＞2为表达阳性。阳性率＝阳性表达人数/总人数×100%。

1.6 RT－PCR

RNA提取、cDNA合成和PCR扩增的实验方法均按照操作说明进行，引物与FQ－PCR相同，用琼脂糖电泳法和溴化乙啶染色观测结果。

1.7 CA153、CEA和TSGF的检测

CA153和CEA采用化学发光法进行测定；TSGF采用酶连续监测法进行测定。

1.8 ER、RR和HER2的检测

采用免疫组织化学Envision二步法，具体步骤按试剂盒说明书进行。

1.9 统计学方法

应用SPSS 17.0软件进行数据分析。定性资料以例数和率表示，各组基因标志物表达阳性率的比较采用χ2检验，与临床病理资料及受体表达的相关性分析采用Spearman等级相关分析，不同方法用于乳腺癌诊断的评价采用 McNemar检验。检验水准α设定为0.05。

2 结果

2.1 HMAM的表达

健康体检者、良性乳腺疾病、其他肿瘤患者和乳腺癌患者 HMAM 阳性率分别为20.0%、31.9%、31.0%和42.0%，乳腺癌患者HMAM阳性率明显高于健康体检者、良性乳腺疾病和其他肿瘤患者，差异有统计学意义（χ2＝5.153，3.797，4.875；P＝0.017，0.029，0.035）；良性乳腺疾病和其他肿瘤患者HMAM阳性率高于健康体检者，差异有统计学意义（χ2＝4.103，4.031；P＝0.024，0.023）；良性乳腺疾病和其他肿瘤患者比较，差异无统计学意义（χ2＝1.069，P＝0.275）。

2.2 HMAM癌基因表达与乳腺癌临床病理因素的关系

193例乳腺癌患者HMAM表达阳性率与患者年龄、肿瘤大小、类型无关（rs＝1.203，1.022，1.021；P＝0.256，0.302，0.391）；与乳腺癌临床分期、组织学分级、腋窝淋巴结转移呈正相关（rs＝5.023，6.236，5.389；P＝0.015，0.011，0.013）（表1）。

2.3 HMAM表达与激素受体的相关性

193例乳腺癌患者HMAM表达与雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）表达无明显相关性（rs＝0.081，0.075；P＝0.324，0.395）；与 HER2/neu表达呈正相关（rs＝0.223，P＝0.012）（表2）。

表1 HMAM表达与乳腺癌患者临床病理学特征的相关性［n（%）］

表2 乳腺癌HMAM表达与激素受体的相关性［n（%）］

2.4 SYBR Green FQ－PCR和 RT－PCR法用于乳腺癌微转移诊断的评价

SYBR Green FQ－PCR检测HMAM对乳腺癌诊断的灵敏度（χ2＝5.715，P＝0.0213）和特异性（χ2＝5.116；P＝0.0325）均高于 RT－PCR法，其差异有统计学意义（表3）。

表3 FQ－PCR和RT－PCR法灵敏度和特异性的比较

2.5 HMAM、CA153、TSGF和CEA对乳腺癌诊断的灵敏度和特异性

HMAM对乳腺癌诊断的灵敏度高于TSGF和CEA，差异有统计学意义（χ2＝4.179，4.251；P＝0.037，0.034），也高于 CA153，但差异无统计学意义（χ2＝2.801；P＝0.098）；特异性高于 CA153、TSGF 和 CEA（χ2＝4.279，4.901，5.231；P ＝0.031，0.027，0.024）（表3～表6）。

表4 CA153对乳腺癌诊断的灵敏度和特异性

表5 TSGF对乳腺癌诊断的灵敏度和特异性

表6 CEA对乳腺癌诊断的灵敏度和特异性

3 讨论

HMAM基因定位于人染色体11q13区域，是子宫珠蛋白超家族成员之一，也是上皮组织来源的组织特异性标志［2］。HMAM基因所编码的蛋白质氨基酸序列与子宫珠蛋白超家族同源，几乎只在乳腺上皮细胞中表达并在乳腺癌组织中过表达，在骨髓中阳性表达预示预后较差。研究发现，HMAM可能与亲脂素B蛋白通过二硫键形成异源二聚体而发挥作用，其异常表达与乳腺癌的微转移和疗效密切相关［3］。HMAM mRNA特异性表达于乳腺组织，而在其他肿瘤如肝癌、肺癌、结直肠癌、胃癌等均不表达［4］。

由于HMAM具有较高组织特异性，在乳腺癌微转移中具较高潜在诊断价值，因此它一直是近年国内外研究较多的乳腺癌相关基因，Tjensvoll等［5］研究显示，5例术前骨髓HMAM阳性表达患者，其中4例术后出现复发。进淑娟等［6］发现患者乳腺癌组织、腋窝淋巴结及外周血中HMAM mRNA表达与乳腺癌的临床分期相关，提示HMAM检测可以反映乳腺癌的微转移。鲍慧铮等［7］在2014年报道，FQ－PCR检测44例乳腺癌患者外周血HMAM 表达阳性率为38.6%，CK19和HMAM联合检测的阳性率为56.8%。

虽然国内外已有关于HMAM对乳腺癌辅助诊断的相关报道，但上述报道主要局限在乳腺癌和良性肿瘤患者，缺少与不同检测方法的比较及于其他肿瘤标志物的比较等，且例数较少，本研究旨在较为全面地探讨HMAM在乳腺癌辅助诊断中的意义。

本研究发现，乳腺癌患者HMAM阳性率明显高于健康体检者、良性乳腺疾病和其他肿瘤患者（P＜0.05），表明 HMAM 可辅助乳腺癌的诊断。在与病理学特性的比较中，HMAM表达与乳腺癌临床分期、组织学分级、腋窝淋巴结转移和HER2/neu表达相关；级别越高的肿瘤阳性率越高，腋窝淋巴结转移者表达高于无转移者。目前，用于乳腺癌诊断的肿瘤标记物主要有CA153、TSGF和CEA等，CA153是报道较多且对乳腺癌特异性较高的标志物，单独应用时其灵敏度低，阳性率仅为22.5%～40.2%［8］；TSGF在恶性肿瘤形成早期，即释放到血液中并达到一定浓度，是恶性肿瘤血管扩增的刺激因子和血管增生的物质基础，而与非肿瘤血管增生无关［9－11］，虽然其灵敏度较高，但特异性差；CEA 的阳性率和特异性也较低。本研究发现，HMAM对乳腺癌诊断的灵敏度（42.0%）高于TSGF（33.7%）和CEA（30.6%），特异性（70.9%）高于 CA153（45.3%）、TSGF（39.0%）和 CEA（36.3%）。

SYBR Green FQ－PCR主要是利用Taq酶5′→3′外切酶活性，在常规PCR基础上加入荧光标记探针进行核酸定量分析，与普通的RT－PCR法相比，具有以下优点：1）在PCR扩增对数期对mRNA的表达进行定量，结果更为可靠；2）扩增和检测同时进行，减少了交叉污染；3）高灵敏性、高特异性和高精确性。本研究SYBR Green FQ－PCR对HMAM检测灵敏度为42.0%，RT－PCR为30.1%，SYBR Green FQ－PCR对 HMAM 检测特异性为70.9%，RTPCR为59.6%；4）高度自动化、快速，可缩短检测时间1～2h。

综上所述，SYBR Green FQ－PCR法能快速定量检测外周血中HMAM的基因表达，具有高灵敏度、高特异性、高精确性、高效率和污染小等特点，且标本来源容易，可为乳腺癌的辅助诊断提供客观可靠的依据。

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