psm－mec在临床分离表皮葡萄球菌中的分布和表达

杨永长，肖代雯，姜 伟，陈 亮，胡洪华，周 薇，黄文芳

四川省医学科学院·四川省人民医院 检验科（成都 610072）

表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis，S.epidermidis）是人体皮肤正常菌，也是引起院内感染常见致病菌。当S.epidermidis在医疗设施中形成生物被膜后，可引起慢性感染和导管相关性感染，难以治愈，已引起医学界广泛关注［1－6］。 但S.epidermidis生物被膜形成的分子机制尚不完全清楚。近年来，国外学者［7－9］研究发现，葡萄球菌染色体mec基因盒（staphyloccoccal cassette chromosome mec，SCCmec）伴随基因psm－mec能调节耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA）生物被膜形成，在具有生物被膜形成能力的S.epidermidis标准菌株RP62A培养上清存在PSM－mec多肽。前期预实验结果显示携带psm－mec基因的耐甲氧西林表皮葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus epidermidis，MRSE）具有生物被膜形成能力，提示psmmec基因可能与MRSE生物被膜相关，但缺乏psmmec在临床分离S.epidermidis中分布和表达的实验证据。本研究采用分子生物学技术探讨psm－mec在临床分离S.epidermidis中的分布和表达，为深入分析其功能提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

165 株S.epidermidis来自2012年3月至2014年3月四川省人民医院住院患者分离的非重复菌株，所有菌株均采用全自动微生物鉴定系统鉴定，其中血液分离138株，痰液分离15株，中段尿液分离5株，伤口分泌物分离7株。S.epidermidis标准菌株ATCC12228为本实验室保存菌株。

1.2 试剂与仪器

细菌 DNA提取试剂（广州达安）；2×Taq Master Mix、Ultra SYBR Mixture 、TRIzon 总RNA提取试剂、HiFi－HMMV逆转录试剂（北京康为世纪）；100bp DNA Ladder（北京天根）；LA Taq高保真DNA聚合酶、dNTPs、10×LA Taq BufferⅡ（TaKaRa）；血平板（郑州安图生物）；琼脂糖（Biowest）；Tris碱（Novon）；PCR扩增仪PTC－200、凝胶成像仪（Bio－Rad）；荧光定量 PCR 仪7500（ABI）；生物安全柜、细胞培养箱（Heal Force）；电泳仪（Sanvant）；紫外分光光度计、高速低温离心机（Eppendorf）；esp，mecA，psm－mec，fudoh 和 p221片段扩增的引物由上海Invitrogen公司合成。

1.3 细菌培养与基因组DNA提取

接种单个菌落至3mL LB液体培养基，37℃220r/min培养过夜。取1mL菌液，离心收集细菌，弃上清。沉淀加入100μL DNA提取液，100℃10min，以10 000r/min离心 5min，离心半径9.5cm，上清即为S.epidermidis DNA，－20℃保存备用。

1.4 PCR扩增esp和mecA

根据文献［10］，采用PCR扩增esp和mecA 进一步区分MRSE和甲氧西林敏感表皮葡萄球菌（methicillin susceptible Staphylococcus epidermidis，MSSE）。

1.5 扩增psm－mec、fudoh和p221基因片段

通过扩增psm－mec、fudoh和p221片段（图1）鉴定携带psm－mec MRSE菌株。psm－mec引物序列、反应体系和扩增条件参考前期研究方法进行［10］。fudoh基因位于SCCmec上，序列包含psmmec全长及其上下游区域，fudoh基因扩增引物序列F：5′－CAATTCACTTGTCTTAAACTTTGTAGA AAAAGAAG－3′，R：5′－TATTTTATTTTCCATA ATTGCCTACCCCATAAG －3′，产物大小为530bp。反应体系：2×Taq Master Mix 10μL，上、下游引物各1μL，DNA 2μL，ddH2O 6μL。反应条件：95℃预变性3min，95℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸5min。p221引 物 序 列 F：5′－CGGGATCCTTTTTCAAATTT TTGACATTTATGC－3′，R：5′－CGGAATTCTTA ACCGAAAGCCTGAATGCAAGTC－3′，产 物 大 小为237bp。反应体系：2×Taq Master Mix 15μL，上、下游引物各1μL，DNA 2μL，ddH2O 11μL。反应条件：95℃预变性3min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸5min。产物经1%琼脂糖凝胶电泳后Bio－Rad凝胶成像仪检测，根据临床分离菌株psm－mec、fudoh和p221片段检测结果鉴定携带psm－mec MRSE。

图1 psm－mec和fudoh基因以及p221片段关系图

1.6 psm－mec基因及其上游序列分析

采用如上所述的方法扩增fudoh基因片段，阳性结果送Invitrogen公司测序，通过NCBI Blast比对软件进行序列分析。

1.7 psm－mec基因在临床分离MRSE中的表达

1.7.1 细菌总RNA的提取 单菌落接种LB液体培养基，37℃220r/min振荡培养至对数生长期，收集约1.5mL菌液于1.5mL Eppendorf管中，以9 700r/min离心2min，离心半径9.5cm，去上清。沉淀加入1mL TRIzon总RNA提取试剂，反复吹打几次，使细菌充分裂解，室温放置5min，使蛋白核酸复合物完全分离。溶液中加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置2～3min。4℃，以10 630r/min离心15min，离心半径9.5cm，室温静置2～3min，此时液体分成3层（红色有机相，中间和上层无色水相，RNA主要在水相中）。小心吸取上层水相（切勿吸到中间层）加入新Eppendorf管中，加入等体积的冷冻异丙醇，将样品上下颠倒混匀，室温放置10min，4℃，以10 630r/min离心10min，离心半径9.5cm，去上清。加入1mL 75%乙醇溶液，涡旋混匀洗涤沉淀，4℃，以8 400r/min离心5min，离心半径9.5cm，去上清。将样品置于超净台中高风速吹干，大约30min。用经过预处理无RNase水溶解，总RNA进行分装，－80℃保存备用。

1.7.2 cDNA合成 以细菌总RNA为模板，采用HiFi逆转录试剂进行cDNA合成，反应体系为20μL：HiFi－MMLV（200U/μL）1μL，5×RT Buffer 4μL，dNTP Mix（2.5mmol/L）4μL，Primer Mix 2μL，RNA template 2μL，DTT（0.1mol/L）2μL，RNase－free water 5μL。42℃孵育50min，70℃孵育15min。反应结束后，以7 520r/min离心1min，离心半径9.5cm，置冰上冷却备用。

1.7.3 psm－mec 定量标准品制备 扩增含psmmec序列的p221序列，将其克隆至穿梭质粒pLI50，构建p221重组质粒，经过酶切证实为p221片段后大量制备质粒并保存质粒菌落。碱裂解法提取质粒，分光光度法测质粒含量，根据质粒含量和长度计算获得质粒拷贝数。用无RNase水稀释5个浓度梯度作为psm－mec定量的标准品。

1.7.4 实时荧光定量逆转录PCR 按照试剂盒说明书进行。定量PCR在Applied Biosystems Real－Time PCR System（ABI 7500）中进行。反应体系为20μL，2×Ultra SYBR Mixture 10μL，上、下游引物（1μmol/L）各0.5μL，cDNA 2μL，RNasefree water 7μL。定量PCR反应条件为95℃预变性10min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸32s，共40个循环，同时设5个浓度梯度标准品、阴性和阳性对照。根据标准曲线对目的基因进行定量分析。

2 结果

2.1 临床分离S.epidermidis以MRSE为主

PCR扩增产物电泳结果显示，165株临床分离细菌均可扩增出esp基因片段，说明这些菌株均为S.epidermidis，与临床微生物学鉴定相符。mecA阳性138株，mecA阴性27株。提示MRSE占临床分离S.epidermidis的83.64%。

2.2 psm－mec仅分布于 MRSE中

165 株临床分离S.epidermidis中有29株可扩增出psm－mec、fudoh基因和p221片段，携带率为17.58%；进一步分析发现，所有psm－mec阳性标本均为MRSE，而27株 MSSE中未扩增出psm－mec基因，提示psm－mec基因仅存在于 MRSE中（图2和图3）。

图2 psm－mec基因在临床分离S.epidermidis中的分布

2.3 psm－mec基因及其上游序列分析

29株psm－mec阳性MRSE均扩增出fudoh基因，测序结果经Blast比对显示，29株psm－mec基因编码序列与数据库完全匹配，表明所有菌株的psmmec基因编码序列无突变位点存在。而其中6株MRSE在psm－mec上游－12处发现单碱基突变（G＞A）（表1）。

表1 临床分离MRSE菌株psm－mec基因突变分析

2.4 psm－mec在MRSE中的表达量检测

为了探讨psm－mec在MRSE中的表达，首先我们构建了含psm－mec的质粒p221，提取质粒后对其进行定量，并计算出其相应的拷贝数，然后将其进行系列梯度稀释，通过SYBR荧光染料法进行PCR扩增，获得扩增曲线，调节基线和阈值，得到标准曲线（图4）。5个浓度梯度获得标准曲线的相关系数为0.997，斜率为－3.27，截距为47.86，提示建立的SYBR荧光定量PCR可对psm－mec基因的表达进行定量分析。

图4 定量PCR检测psm－mec表达量的标准曲线

提取20个psm－mec阳性MRSE的总RNA，通过逆转录获得cDNA，运用上述的SYBR荧光定量PCR方法对临床分离MRSE的psm－mec进行定量分析。通过分析发现，所有标本均有psm－mec表达，其表达量在103～107拷贝之间。进一步分析G＞A点突变株与野生株之间psm－mec转录水平的差异，结果显示突变株和野生株之间psm－mec的表达无明显差异，提示G＞A点突变不影响psm－mec基因转录（图5）。

图5 临床分离psm－mec阳性MRSE菌株的psm－mec基因表达情况

3 讨论

定植人体皮肤表面的S.epidermidis是一种重要的院内感染条件致病菌，免疫抑制患者中大部分慢性感染和导管相关感染均由S.epidermidis引起［1］。在美国，22%ICU 患者的血流感染和13%人造瓣膜心内膜炎归咎于S.epidermidis，每年用于治疗S.epidermidis感染的费用高达20亿美元左右［2］。我国一项涉及15个城市、17家医院的调查显示，80%以上临床分离S.epidermidis为MRSE［3］。近年来，MRSE的检出率越来越高，已成为全球院内感染的重要病原菌［4－5］。

生物被膜形成是S.epidermidis的主要致病机制［6］，其分子机制尚不完全清楚。研究［7］发现，可移动SCCmec上存在一种具有调节MRSA生物被膜的新基因psm－mec，该基因只存在院内感染MRSA中，而在社区获得性MRSA中尚未发现此基因。由于MRSA的SCCmec可能来源于MRSE，因此我们设想院内感染分离的临床MRSE菌株可能也携带psm－mec基因。本研究收集了165株临床分离S.epidermidis，通过微生物学和分子生物学区分MRSE和MSSE，由于fudoh基因和p221片段覆盖psm－mec序列全长及其上游区域［8］，我们通过PCR扩增psm－mec、fudoh基因和p221片段证实165株临床分离S.epidermidis中，携带psm－mec基因的菌株为29株，在MRSE中占17.58%，高于MRSA中10%左右的携带率，提示psm－mec在临床分离MRSE中存在更为普遍，对其在生物被膜形成过程中作用的研究更有意义。统计分析发现，psmmec仅分布于MRSE中。

为了研究psm－mec表达，我们构建了含有psmmec基因的重组质粒p221，并通过计算和梯度稀释获得荧光定量PCR检测psm－mec标准品。提取携带psm－mec基因的MRSE细菌总RNA，逆转录后通过荧光定量PCR检测发现，所有临床分离的携带psm－mec基因的MRSE均表达此基因，说明这些携带菌株都表达psm－mec mRNA。

DNA序列分析显示，在psm－mec ORF区域无碱基突变，且与数据库序列完全一致，进一步证实psm－mec基因在 MRSE中的分布。同时少部分psm－mec存在－12G＞A点突变，与 MRSA中psmmec的突变模式（－7T＞C）不同［11］。在 MRSA中，psm－mec突变将导致毒力增加和生物被膜形成能力降低。我们推测在MRSA中psm－mec的突变可能抑制了其mRNA的表达，从而降低生物被膜形成能力。本研究通过荧光定量RT－PCR证实，－12G＞A点突变不影响psm－mec基因转录。

综上所述，psm－mec仅分布和表达于部分临床分离MRSE中，psm－mec上游－12G＞A点突变不影响psm－mec的表达，为探讨psm－mec与生物被膜之间的关系及分子机制提供了依据。

［1］Otto M.Staphylococcus epidermidis—the ‘accidental′pathogen［J］.Nat Rev Microbiol，2009，7（8）：555－567.

［2］Rogers KL，Fey PD， Rupp ME.Coagulase－negative staphylococcal infections［J］.Infect Dis Clin North Am，2009，23（1）：73－98.

［3］Xiao YH，Wang J，Li Y，et al.Bacterial resistance surveillance in China：a report from Mohnarin 2004－2005［J］.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2008，27（8）：697－708.

［4］Raad I，Hanna H，Maki D.Intravascular catheter－related infections：advances in diagnosis，prevention，and management［J］.Lancet Infect Dis，2007，7（10）：645－657.

［5］Xu Z，Shi L，Alam MJ，et al.Integron－bearing methicillin－resistant coagulase－negative staphylococci in South China，2001－2004［J］.FEMS Microbiol Lett，2008，278（2）：223－230.

［6］Otto M.Molecular basis of Staphylococcus epidermidis infections［J］.Semin Immunopathol，2012，34（2）：201－214.

［7］Queck SY，Khan BA，Wang R，et al.Mobile genetic elementencoded cytolysin connects virulence to methicillin resistance in MRSA［J］.PLoS Pathog，2009，5（7）：1000533.

［8］Kaito C，Saito Y，Nagano G，et al.Transcription and translation products of the cytolysin gene psm－mec on the mobile genetic element SCCmec regulate Staphylococcus aureus virulence［J］.PLoS Pathog，2011，7（2）：1001267.

［9］Aoyagi T，Kaito C，Sekimizu K，et al.Impact of psm－mec in the mobile genetic element on the clinical characteristics and outcome of SCCmec－II methicillin－resistant Staphylococcus aureus bacteraemia in Japan［J］.Clin Microbiol Infect，2014，20（9）：912－919.

［10］杨永长，陈亮，肖代雯，等.携带psm－mec基因的耐甲氧西林表皮葡萄球菌产细菌生物膜的能力研究［J］.临床检验杂志，2014，32（9）：700－702.

［11］Kaito C，Saito Y，Ikuo M，et al.Mobile genetic element SCCmec－encoded psm－mec RNA suppresses translation of agrA and attenuates MRSA virulence ［J］.PLoS Pathog，2013，9（4）：1003269.