缺氧环境对成牙骨质细胞成骨功能调节的研究

吴 浩，韩红娟，任小华，梁 琳

1.四川省医学科学院· 四川省人民医院 口腔科（成都 610072）；2.四川省医学科学院·四川省人民医院 药学部（成都 610072）

成骨类细胞的成骨功能与细胞的生理功能息息相关，其功能表现主要为多种成骨相关蛋白表达的调控［1］，牙根表面的牙骨质中大约含有45%～50%无机物（主要为羟基磷灰石）和50%有机物（主要为胶原及非胶原蛋白）。这些蛋白在正畸矫治引起的牙根吸收与修复平衡中发挥着重要作用［2］。成牙骨质细胞在细胞特征、功能表达等多方面与成骨细胞有许多共性，大量的实验研究［3］表明，缺氧能促进成骨细胞内的缺氧敏感基因表达，如碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨钙素（osteocalcin，OCN）、骨涎蛋白（bonesialoprotein，BSP）等，但却很少见缺氧调控成牙骨质细胞矿化功能的相关报道。本文拟对缺氧环境下成牙骨质细胞成骨功能的调节作初步探讨，为正畸牙移动提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验所使用的细胞为美国华盛顿大学Somerman教授实验室提供的成牙骨质样细胞株OCCM－30。相关研究［4］表明，OCCM－30细胞的主要性能完全符合成牙骨质细胞功能特点，是成熟、稳定的成牙骨质细胞株体系，能作为研究成牙骨质细胞相关调控功能的模型。

1.2 方法

1.2.1 细胞缺氧模型构建 采用德国Binder三气培养箱，通过控制N2的输入量，用传感器来实现对O2浓度的实时精确控制。将细胞按1×105个／mL接种于中号培养瓶（50mL）内，每瓶2mL，镜下观察细胞大部分贴壁后（约12h），将培养瓶转移至三气缺氧箱内，当氧气浓度降至预设浓度时（1～2h），开始计时。缺氧组条件设置：2%O2、5%CO2、93%N2；对照组培养条件：20%O2、5%CO2、75%N2（细胞正常培养条件）。检测时间点：0、6、12、24、36、48、72h。缺氧完成后按检测手段分别收集细胞。

1.2.2 RT－PCR检测 引物由宝生物公司代为合成 及 测 试。ALP 正 向 引 物：5＇－CCCCCCGTGG CAACTCTATCTT－3＇，反向引物：5＇－GTAGTTC TGCTCGTGGACGCCG－3＇。OCN 正 向 引 物：5＇－GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG－3＇，反向引物：5＇－GTCAGCCAACTCGTCACAGT－3＇。BSP 正 向 引物：5＇－CTGAAGAAAAACGGGGTCTTTAAG－3＇，反向引物：5＇－ATTGGAGACGGCGATAGTTC－3＇。PCR反应体系总体积20μL，包括PCR正向、反向引物各0.8μL，SYBR Premix Ex Taq 10μL，ROX Reference Dye（50×）0.4μL，ddH2O6μL，DNA模板2μL。设置好反应条件后，计算机系统自动控制反应并实时检测，绘制扩增曲线并分析，运用△Ct法来评价实验结果。

1.3 统计学方法

采用SPSS 11.0统计软件进行分析，数据以均数±标准差（±s）表示。采用SNK法、单因素方差分析法（one－way analysis of variance，ANOVA）进行比较，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 OCCM－30细胞中ALP mRNA的表达变化

缺氧能显著诱导ALP mRNA的表达，缺氧后6h，ALP mRNA的表达开始上调，12h达顶峰，此后开始下降，36、48及72h与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（图1）。

图1 OCCM－30细胞缺氧后ALP mRNA的表达变化

2.2 OCCM－30细胞中OCN mRNA的表达变化

缺氧环境OCN mRNA表达的调控表现为先促进后抑制，随着缺氧的开始，OCN mRNA的表达逐步上调，在12h达峰值，然后再逐步下降，24、36h与对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），48、72h表达较对照组低（P＜0.05）（图2）。

图2 OCCM－30细胞缺氧后OCN mRNA的表达变化

2.3 OCCM－30细胞中BSP mRNA的表达变化

总体上来讲，缺氧能显著抑制BSP mRNA的表达，随着缺氧的开始，BSP mRNA的表达逐步下调，在24、36、48和72h，与对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。但12h时BSP mRNA表达较对照组高，可能是因为在缺氧早期，OCCM－30细胞的数量在短期内继续升高，造成BSP mRNA的相对数量较高。（图3）

图3 OCCM－30细胞缺氧后BSP mRNA的表达变化

3 讨论

ALP能代表细胞成骨能力和分化成熟程度，是一类促进钙离子和无机盐沉积的促矿化蛋白［5］，广泛存在于细胞释放的基质小泡及成骨细胞的表面。在成骨活跃的细胞体系中，ALP的活性普遍增强［6］，因而被认为是成骨活性的代表蛋白之一。成牙骨质细胞与成骨细胞在功能上相似，成骨类细胞表达ALP得到了普遍认可，但由于成牙骨质细胞的特殊性，ALP在成牙骨质细胞中的表达在不同研究中结果存在差异。Grzesik等［7］培养的成牙骨质细胞不表达ALP mRNA或仅有极微量的表达。然而更多的文献则表明ALP在成牙骨质细胞中的表达与在成骨细胞中相似。Mada等［8］1995年报道在外源性前列腺素E2的诱导下，ALP活性显著提高，证明外源性前列腺素E2上调ALP的活性及抑制矿化的作用是通过EP4途径实现的。Bachra［9］则认为，ALP能转运磷酸基至细胞间质中并降低抑制矿化因子的作用，是细胞分化的前期标志。本研究支持成牙骨质细胞表达ALP。缺氧开始后，ALP mRNA的表达较对照组显著上调，在12h达峰值，但36h与对照组无差别；OCCM－30细胞缺氧后ALP活性呈现随时间的起伏变化，在12、36h表达高于对照组，24、48h低于对照组。ALP mRNA在缺氧后的上升是细胞成骨能力在基因转录水平的表达，但随着缺氧时间的延长，细胞整体活力下降，新陈代谢发生改变，抑制了从ALP mRNA翻译为蛋白的机制，所以整体上ALP活性在蛋白水平变化不大。

作为骨形成、骨转化的特征，OCN是一种由成骨细胞合成的广泛存在于骨基质（骨、牙骨质及牙本质）的非胶原蛋白，在成骨细胞成熟的最后阶段（基质矿化）表达。Pearson［10］认为，保持骨正常的矿化速率，防止生成非正常磷灰石，控制发生矿化的起止边界是OCN的主要功能，并随着矿化速率的加快其表达增加。在对成牙骨质细胞的研究中也发现了类似的规律，OCN的表达量与细胞外矿化程度呈现正相关。Bodine等［11］在1999年的研究指出，OCN通过诱导、活化破骨细胞可以起到调控骨吸收的作用。本研究显示，OCN mRNA的表达随着缺氧时间延长而逐步上调，在12h达最高，随后逐步下调，在24、36h与对照组相比无明显差异，48h后明显低于对照组，而OCN蛋白的表达量与mRNA的变化情况相似，在36h达峰值后逐步下降，在时效性上具有延后性。结果提示，短时间的缺氧能刺激成牙骨质细胞的分化及矿化能力的表达，但长时间的刺激能抑制成牙骨质细胞的矿化。

BSP是在牙骨质刚开始形成时高表达的非胶原蛋白，其主要作用是控制磷灰石晶核的生成和发展。Alford等［12］指出，在牙骨质发生矿化的过程中，形成的速度越快，所检测到的BSP含量就越多，BSP与骨桥蛋白（OPN）一起相互作用，在牙骨质的形成中起着不可替代的关键作用，其表达区域主要为牙根的表面。Nanci［13］的研究表明，成熟的成骨样细胞能分泌高度磷酸化和硫酸化的BSP，同时还能促进其他成骨样细胞的聚集及黏附，有生理性吸收及修复现象的牙根在反转线上，BSP的表达非常强烈，这说明BSP能抑制骨基质的吸收并促进矿化开始。本研究发现BSP mRNA的表达能被缺氧显著抑制，且呈现逐渐降低的趋势，这符合缺氧能抑制成骨的结论，但12h时BSP mRNA表达增高的原因有待进一步研究。

ALP、OCN及BSP是成牙骨质细胞矿化过程中非常重要的因子，综合上述三个因子的mRNA表达变化，总体来说，短时间的缺氧能刺激OCCM－30细胞的成骨能力，随着缺氧时间的延长，成骨功能被抑制。在正畸临床中，长时间持续的加力能造成长时间的缺氧环境，抑制了牙槽骨内的成骨细胞及牙根表面的成牙骨质细胞的生物活性，甚至造成细胞、组织的病理性改变，出现牙根过度吸收，牙槽骨透明样变化。持续的重力在正畸矫治过程中不仅不能加快牙移动的速率，反而会造成不良的副作用；相反间断的轻力能在牙周膜中形成轻微的、短时间的缺氧环境，可以活化成牙骨质细胞及成骨细胞，既避免了副作用又加快了牙移动的速度。在此观点上，本研究结果与临床实践较为一致。

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