保留根面牙骨质对人牙周韧带细胞分化的影响

徐岩，蔡军(济南市口腔医院，济南250014)



保留根面牙骨质对人牙周韧带细胞分化的影响

徐岩，蔡军
(济南市口腔医院，济南250014)

目的 观察保留健康牙骨质对人牙周韧带细胞分化的影响。方法 取正畸患者拔除的健康前磨牙，从牙根的近中和远中面釉牙骨质界下2 mm制备对称的5 mm×4 mm的牙片43对，随机分成观察组(保留牙骨质)和对照组(去除牙骨质)各43张。刮取牙周膜组织，按组织块贴壁法培养牙周韧带细胞，分离培养后，取两组各23张牙片，将细胞接种到牙片上共培养，制成PDLC-牙片复合体。7 d后刮除并收集PDLC-牙片复合体上的细胞，采用RT-PCR方法检测成牙骨质标记物牙骨质附着蛋白(CAP)和牙骨质蛋白23(CP-23)表达。取两组剩余的20张牙片制成细胞-牙片复合体放入半透明膜中，植入裸鼠体内，8周后比较两组牙片表面新形成的硬组织情况，并采用免疫组化方法观察骨桥蛋白(OPN)和骨唾液蛋白(BSP)表达。结果 观察组CAP和CP-23表达较对照组升高(P均<0.01)。植入裸鼠体内，8周后观察组14张牙片显示原有牙骨质上有牙骨质样基质形成；新旧牙骨质间并未观察到裂隙。对照组17张牙片在牙根表面有纤维组织形成，并且新纤维组织和牙本质表面间均可观察到不同宽度的裂隙。新形成的牙骨质样基质中，骨桥蛋白和骨唾液蛋白均呈阳性。结论 保留健康牙根表面的牙骨质可能促进人牙周韧带细胞向成牙骨质细胞分化，有利于牙周组织愈合。

牙骨质；牙周组织；细胞分化；牙周韧带细胞；牙骨质细胞；牙骨质附着蛋白；牙骨质蛋白23；骨桥蛋白；骨唾液蛋白

牙骨质是覆盖于牙根表面的独特矿化组织，是一薄层结缔组织覆盖根面，其主要作用是铆钉牙周膜纤维，对于牙齿以及牙周组织的稳定有着重要的作用[1]。以往的牙周组织再生实验以及临床牙周治疗中，一般建议将牙骨质完全去除，目的是将病变牙骨质完全去除。在牙周炎的过程中，牙骨质会在结构和生化形状上发生变化[2]。牙骨质中含有一些与牙骨质形成、牙周韧带附着及牙周韧带细胞(PDLC)胞外基质的合成等有关的非胶原蛋白质。研究显示，牙骨质至少含有两种特异性蛋白，即牙骨质附着蛋白(CAP)[3]和牙骨质源性生长因子(CGF)[4]，它们是存在于牙骨质基质中并能促进牙周膜细胞黏附、增殖、趋化、移行以及成牙骨质细胞分化等功能的活性物质。牙骨质蛋白23(CP-23)是鉴别牙骨质样细胞的标记物[5]，能够在人成牙骨质细胞来源细胞系的培养基中识别出来。而PDLC不是单一细胞类型，其具有多向分化潜能，在适当的环境条件和刺激因素作用下，可以向成骨细胞和成牙骨质细胞方向分化，形成牙骨质和牙槽骨[6]。2006年3月～2007年12月，我们将PDLC细胞与牙片共培养后，检测细胞中CAP、CP-23 mRNA的表达，并将保留牙骨质的牙片与不保留牙骨质的牙片制成PDLC-牙片复合体植入裸鼠体内，8周后观察牙片表面硬组织形成情况，牙片中骨唾液蛋白(BSP)和骨桥蛋白(OPN)表达情况，探讨健康牙根表面的牙骨质能否促进人PDLC向成牙骨质细胞分化，探索根面保留牙骨质对牙周组织再生的影响，为牙骨质的发育机制以及影响牙周组织再生的因素提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料 收集25例正畸患者拔除的43颗前磨牙，患者年龄12～20岁。4周龄健康裸鼠20只，雌雄不限，购于北京大学医学部动物中心，体质量18～24 g。DMEM培养液、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco，USA)；青霉素、链霉素(以下简称双抗，华北制药股份有限公司)；EDTA(华美生物工程公司)；TRIzol(上海生工生物工程技术服务有限公司)；cDNA反转录试剂盒(Fermentas，USA)；PCR扩增试剂盒(大连宝生物工程有限公司)；兔抗人骨桥蛋白(LF-123)、兔抗人骨唾液蛋白(LF-100)；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(北京金桥国际公司)；实时RT-PCR仪；倒置相差显微镜及照相系统(日本Olympus)。

1.2 PDLC的培养 刮取牙根中1/3部位的牙周膜组织，按组织块贴壁法，加入含150 mL/L胎牛血清的DMEM培养液，37 ℃、5% CO2条件下培养。待细胞长满瓶底的70%～80%，按1∶2传代。收集第二代PDLC制成细胞悬液，调整细胞密度为1×106/mL。

1.3 牙片的制备 取43颗前磨牙，刮除根近中和远中面的牙周韧带，将牙根纵劈为两半，去除牙髓组织。一半彻底刮除根面牙骨质，暴露牙本质，作为对照组；另一半则保留牙骨质，不暴露其下的牙本质，作为观察组。用细金刚砂车针从牙根邻面釉牙骨质界下2 mm制备对称的5 mm×4 mm的牙片43对。

1.4 PDLC-牙片复合体的制备 将两组牙片放置在培养皿中，表面用EDTA凝胶处理3 min，暴露胶原。取牙片置于48孔板内，加入制备好的PDLC悬液，37 ℃、50 mL/L CO2、饱和湿度的培养箱中孵育2.5 h。加入含胎牛血清的DMEM培养液继续培育7 d。待细胞长满孔板底部，取出PDLC-牙片复合体，用于以下实验。

1.5 PDLC中CAP、CP23 mRNA表达检测 采用RT-PCR方法。取两组各23个PDLC-牙片复合体，收集牙片上的细胞。使用TRIzol试剂盒提取RNA，反转录合成cDNA，保存于-20 ℃备用。以β-actin作为内参基因，设计并合成引物。CAP引物序列：上游5′-CCTGGCTCACCTTCTACGAC-3′，下游5′-CCTCAAGCAAGGCAAATGTC-3′；CP-23引物序列：上游5′-GGCGATGCTCAACCTCTAAC-3′，下游5′-CCTCAAGCAAGGCAAATTC-3′；β-actin引物序列：上游5′-GATGAGATTGGCATGGCTTT-3′，下游5′-CACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。扩增条件：95 ℃ 10 min预变性；95 ℃ 10 s，59 ℃ 5 s，72 ℃ 10 s，循环45次。标准曲线使用LightCycler 4.0软件分析，以目的基因与β-actin的灰度比值表示目的基因的相对表达量。

1.6 PDLC-牙片复合体的活体植入 取两组剩余的20个PDLC-牙片复合体，放入已消毒的聚四氟乙烯微孔薄膜呈袋状包被，防止移植后裸鼠细胞浸润根片。将裸鼠用氯胺酮5 mg/kg腹膜下注射麻醉，于背部两侧分别作2个纵切口，分离、暴露皮下组织。将已包被的PDLC-牙片复合体植入裸鼠皮下，一侧为牙骨质片，另一侧为牙本质片，缝合伤口。饲养8周后以断颈法处死裸鼠，将牙片取出。

1.7 牙片表面新生组织观察 将牙片用多聚甲醛溶液4 ℃下固定24 h，加入140 g/L EDTA脱钙液脱钙，取出牙片冲洗，脱水，石蜡包埋。与牙长轴平行，近远中向制作5 μm连续切片，取经过中间部分的切片，行HE染色，倒置相差显微镜下观察牙片表面是否有新生成的组织。

1.8 牙片中BSP、OPN表达检测 采用免疫组化方法。将切取的牙片加入一抗(兔抗人OPN、兔抗人BSP)，1∶100稀释，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体作为二抗，DAB显色。镜下观察牙片中有棕色染色为BSP、OPN阳性。

2 结果

2.1 两组PDLC中CAP、CP-23 mRNA表达比较 与PDLC细胞共培养7 d后，观察组PDLC中CAP、CP-23 mRNA的相对表达量分别为0.004 35±0.000 34、0.000 07±0.000 02，对照组分别为0.002 91±0.000 21、0.000 000 66±0.000 000 04，观察组CAP、CP-23 mRNA表达均高于对照组(P均<0.01)。

2.2 两组牙片新组织形成情况 观察组中，有14个牙片在原有的牙骨质表面有一层新形成的牙骨质样基质(NFC)，而且NFC的密度比较低，部分有细胞嵌入。在NFC和聚四氟乙烯微孔薄膜之间有疏松的纤维样组织，空隙较大。而对照组无新的牙骨质形成，有新生成的纤维样组织形成，与根面之间有很大的间隙，并且越靠近根面密度越大。

2.3 观察组牙片中BSP、OPN表达情况 BSP在NFC中呈弱阳性，越靠近根面染色越强；在原有的牙骨质和牙本质中染色不明显。OPN在NFC中呈阳性，越靠近原有的牙骨质阳性越强，在原有牙骨质呈中等阳性，在牙本质中没有着色。

3 讨论

牙骨质除了能够提供牙周组织的附着，也可以保护牙本质，阻止牙本质在病理条件下吸收。即使暴露在牙周袋中，牙骨质也不是很容易发生吸收[7]。在体内暴露牙本质可以引起破骨细胞在牙根基面启动吸收过程，这可能唤起趋化因子和激活信号的激活[8]。基于这一点，牙骨质和牙本质在调节和招募PDLC方面有很大不同。本研究结果显示，在体外牙骨质和牙本质表面出现了PDLC的黏附和生成。

成牙骨质细胞能够生成牙骨质，但是它们同成骨细胞相似，很难区分。CAP是一种胶原样蛋白，可作为成人PDLC中特定的成牙骨质细胞祖细胞的标记物[9]。CP-23是鉴别牙骨质样细胞的标记物[5]，能够在人成牙骨质细胞来源细胞系的培养基中识别出来。本研究显示，接种于牙骨质和牙本质表面的PDLC中均有CAP、CP-23 mRNA表达，与对照组比较，观察组CP-23 mRNA表达升高，表明先前存在的牙骨质可能促进PDLC向成牙骨质细胞分化。

我们将PDLC-牙片复合体接种到裸鼠皮下，饲养8周后发现，NFC直接形成在原有的牙骨质表面，其密度和结构较原有的牙骨质疏松，部分牙片中可见少量细胞嵌入基质内。免疫组化染色显示，NFC中BSP、OPN均呈阳性。BSP、OPN参与组织矿化，在成牙骨质细胞祖细胞向成牙骨质细胞分化过程中扮演重要角色[11]。其表达与新的牙骨质附着有关[12]。表明PDLC细胞在原有牙骨质存在的情况下，能够促进其向成牙骨质细胞方向分化。除了在原有的牙骨质表面形成NFC，PLDC还可以形成纤维样组织，且牙骨质上的纤维样组织少于牙本质。表明移植到牙骨质上的细胞能够形成牙骨质样结构和纤维样结构，而移植到牙本质上的细胞形成了更多的纤维样组织。这可能解释了PLDC的异质性。

牙周韧带中包含各种类型的细胞，包括成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞、成骨细胞、成牙骨质细胞和间充质干细胞。因此，体外培养PDLC可能会形成多样性的细胞群，而且PDLC中有一定数量的干细胞存在[13]。本研究结果显示，当PDLC接种到牙片上时，牙骨质的存留更适合PDLC中干细胞或成牙骨质细胞的祖细胞分化为成牙骨质细胞，同时在PDLC中的成纤维细胞形成薄的纤维组织。然而牙本质表面更适合于成纤维细胞的生长，形成更多的纤维组织。

在临床治疗牙周炎时，为了将病变牙骨质彻底清除，一般建议将牙骨质完全去除。本研究结果显示，保留牙根表面部分的牙骨质可以促进人牙周韧带细胞向成牙骨质细胞分化，形成NFC，有利于牙骨质的修复以及牙周组织的愈合；完全去除牙骨质反而不利于牙周组织的再生和愈合。因此建议，在临床治疗中，宜用温和的力量去除病变牙骨质的表面层，只去除牙根表面感染的牙骨质而保留大部分牙骨质，更有利于患者的预后。

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山东省优秀中青年科学家科研奖励基金(BS2013YY056)。

蔡军(E-mail: caijun168168@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.26.012

R78

A

1002-266X(2017)26-0041-03

2017-03-01)