固定化混合微生物对Cr（Ⅵ）的去除效应

许 燕，陈晓明，王 超，刘小玲，阮 晨，宋 收

（1.西南科技大学生命科学与工程学院，四川 绵阳 621010；2.西南科技大学核废物与环境安全国防重点学科实验室，四川 绵阳 621010）

铬是工业上最广泛应用的金属之一［1］。铬的毒性主要来自于六价铬［Cr（Ⅵ）］，其被列为对人体危害最大的8种化合物之一，是国际公认的3种致癌金属之一，同时也是美国EPA 公认的129种重点污染物之一［2-3］。含Cr（Ⅵ）的废水主要来源于印染、劣质化妆品原料、制革、颜料、电镀、冶金等行业［4-5］。由于铬很容易穿透细胞膜引发各种急性和慢性疾病，因此含Cr（Ⅵ）废水的处理厄待解决［6-8］。

传统含Cr（Ⅵ）废水的处理方法在不同程度上存在着各种缺陷［9-10］，对此许多学者、研究人员已将注意力从传统方法上转移到新型方法——生物法上［11-12］。本文将高效菌株以一定比例混合，经过海藻酸钠（SA）固定后处理含Cr（Ⅵ）废水，探讨混合后的微生物和固定化混合微生物技术对Cr（Ⅵ）的去除效应［13］，以为处理含Cr（Ⅵ）废水寻找高效菌株提供新的途径，也为从混合菌株方面提高固定化微生物技术处理Cr（Ⅵ）的效率提供有效措施。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要试剂和仪器

试剂：DPC（二苯基碳酰二肼，分析纯，天津市福晨化学试剂厂）；重铬酸钾（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）；LB培养基。

仪器：GH 型隔水培养箱（天津泰斯特仪器有限公司）；SW-CJ-1F 超净工作台（苏净集团安泰公司）；THZ-98AB型恒温振荡器（上海一恒科学仪器有限公司）；SPECORD 200PLUS型紫外可见分光光度计（德国耶拿分析仪器股份公司）。

1.1.2 供试菌株

Ua菌株：萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus），从若尔盖铀矿堆分离而得的优势菌株。

XJ-Ⅱ菌株：枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis），从新疆盐碱地分离而得的优势菌株。

HB 菌株：枯草芽孢杆菌黑色变种（Bacillus subtilis var.），从中国微生物菌种保藏中心购买。

1.2 试验方法

1.2.1 Cr（Ⅵ）溶液浓度测定方法

采用二苯碳酰二肼分光光度法（GB 7466—87）［14］测定Cr（Ⅵ）溶液的浓度。

1.2.2 单一菌株的性能研究

将HB菌、Ua菌和XJ-Ⅱ菌分别接种于不同浓度的Cr（Ⅵ）溶液中，探讨其对Cr（Ⅵ）的耐受性和去除效应。取斜面培养得OD600=0.8 的种子液，以10%的接种量接种于含不同浓度Cr（Ⅵ）的液体培养基中；60h 内每隔一段时间取出一定量液体，测量菌液的OD600值，每次3个重复（下同），以培养基为对照；离心取上清液，测量溶液中残留的Cr（Ⅵ）浓度，以纯水为对照。

1.2.3 混合菌株的性能研究

将3种菌株的种子液以1∶1∶1的比例混合及两两之间以1∶1的比例混合，分别以10%的接种量接种于含不同浓度Cr（Ⅵ）的液体培养基中；120 h内每隔一段时间取出一定量液体，测量菌液的OD600值，以培养基为对照；离心取上清液，测量溶液中残留的Cr（Ⅵ）浓度，以纯水为对照。

1.2.4 混合菌株的固定化研究

由于游离菌株处理废水后仍然分散于废水中，其分离难度大，后期处理不易，而固定化技术恰好可以解决这一问题，因此本试验对其进行了固定化研究。由早期研究得知，40%LB培养基足以提供菌体生长所需要的营养，因此继续采用40%LB 培养基进行后续研究。

取100mL培养36hOD600=3.5的混合菌株离心后的沉淀，溶入10mL 终浓度为1.5%的SA 溶液中，搅拌均匀后滴入1%CaCl2溶液中，固定化1h后取出，生理盐水洗净，备用。

在40mg／L的Cr（Ⅵ）溶液中添加40% LB 培养基，用固定化混合微生物颗粒处理100 mL 上述溶液；96h 内每隔一段时间测量溶液中残留的Cr（Ⅵ）浓度，以固定化颗粒为对照。

2 结果与讨论

2.1 单一菌株的性能研究

分别以10%的接种量接种HB菌、Ua菌和XJ-Ⅱ菌到含不同浓度Cr（Ⅵ）的液体培养基中，考察其对Cr（Ⅵ）的耐受性和去除效应，其试验结果见图1和图2。

由图1可知：在40mg／L 的Cr（Ⅵ）溶液中，接种HB菌的溶液OD600值在48h时达到最大，为4.6左右；接种Ua菌和XJ-Ⅱ菌在加入Cr（Ⅵ）溶液后，OD600值降低，说明有Cr（Ⅵ）存在时，这两种菌体生长受到抑制，耐受性变差，生长速率变慢；而HB 菌在40mg／L的Cr（Ⅵ）溶液中稳定期的OD600值大于对照组的OD600值，可能是由于HB 菌对低浓度Cr（Ⅵ）有较强的耐受性，因此在低浓度Cr（Ⅵ）的刺激作用下，OD600值上升；之后HB 菌在60mg／L 的Cr（Ⅵ）浓度下，可能由于Cr（Ⅵ）浓度增大对其产生抑制作用，HB菌的耐受性降低，导致OD600值降低。总之，不同菌对Cr（Ⅵ）的耐受性能不同，3种菌株对Cr（Ⅵ）的耐受性依次为HB菌＞Ua菌＞XJ-Ⅱ菌。

由图2可知：3种菌株均在48h时趋于Cr（Ⅵ）的最大去除率，其中Ua菌和XJ-Ⅱ菌对40 mg／L Cr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的去除率仅为60%左右，而HB菌对40mg／LCr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的去除率达到98%左右，对60mg／LCr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的去除率也能达到81%以上，说明不同的菌株对Cr（Ⅵ）有不同的去除效果，3种菌株对Cr（Ⅵ）的去除能力依次为HB菌＞Ua菌＞XJ-Ⅱ菌。

张 慧［15］用曲霉（Aspergillus sp.）处 理20 mg／L的Cr（Ⅵ）溶液，Cr（Ⅵ）的去除率达到97.9%；金科等［16］用黄孢原毛平革菌吸附40 mg／L 的Cr（Ⅵ）溶液，Cr（Ⅵ）的去除率为60%左右；相比之下，本文采用的3种菌株处理40mg／L 和60mg／L 的Cr（Ⅵ）溶液，Cr（Ⅵ）的去除率是相当可观的。

2.2 混合菌株的性能研究

不同菌株之间存在协同或拮抗作用，协同作用可提高对Cr（Ⅵ）的吸附效率。为了得到具有协同作用的混合菌株，将3种菌株的种子液以1∶1∶1的比例混合及两两之间以1∶1的比例混合后，分别以10%的接种量接种于60mg／L Cr（Ⅵ）的液体培养基中，考察其对Cr（Ⅵ）的耐受性和去除效应，其试验结果见图3至图4。

由图3可知：HB菌与XJ-Ⅱ菌组合和HB菌与Ua菌组合OD600最大值均为4.7左右，而Ua菌与XJ-Ⅱ菌组合OD600最大值只有0.8左右；同图1相比，HB菌与XJ-Ⅱ菌组合和HB 菌与Ua菌组合的混合菌株OD600值大于单一菌株OD600值，而Ua菌与XJ-Ⅱ菌组合的混合菌株OD600值远远低于单一菌株OD600值，说明前两种组合可能存在协同作用，后一种组合可能由于拮抗作用，菌体几乎不生长，导致OD600值大大降低；而3 种菌株混合的组合可能由于同时存在协同和拮抗作用，因此其OD600值在单一菌株OD600值之间。

由图4可知：HB菌与XJ-Ⅱ菌组合和HB菌与Ua菌组合对60mg／LCr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的最大去除率均达到92%左右，而Ua菌与XJ-Ⅱ菌组合对60mg／L Cr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的最大去除率仅31%左右；同图2比较，HB 菌与XJ-Ⅱ菌组合、HB菌与Ua菌组合对60 mg／L Cr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的去除率比单一菌株Ua 菌、XJ-Ⅱ菌对40 mg／L Cr（Ⅵ）溶液中的Cr（Ⅵ）和HB菌对60mg／LCr（Ⅵ）溶液中的Cr（Ⅵ）的去除率均大，说明这两个组合可能存在协同作用，使其去除率增大；而Ua菌与XJ-Ⅱ菌组合对Cr（Ⅵ）的去除率比其单一菌株对Cr（Ⅵ）的去除率降低较多，说明这一组合之间不仅没有协同作用，还可能存在拮抗作用，导致其去除率降低。由于HB 菌与XJ-Ⅱ菌组合和HB 菌与Ua菌组合均具有较强的协同作用，因此将其用于进一步的固定化研究。

何丽媛等［17］将从污染土壤中分离筛选到的4株石油组分降解菌用于组建降解原油的混合菌体系来处理原油，得到处理原油的最佳组合，其总去除率达69.20%，比单菌提高了近30%；陈丽华等［18］用混合菌剂对石油污染土壤进行降解，结果表明加入高效降解混合菌的石油降解率提高了20%以上。本研究中采用混合微生物技术处理含Cr（Ⅵ）废水，混合微生物对60mg／LCr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的去除率比单一菌株Cr（Ⅵ）的最大去除率还要提高10%以上。

2.3 混合菌株的固定化研究

由于固定化技术可以解决游离微生物的一些关键缺陷，因此本研究将利用混合微生物进行固定化处理含Cr（Ⅵ）废水。

将100mL OD600=3.5的混合菌株离心后的沉淀进行固定化，再用其处理100mL含40%LB培养基的Cr（Ⅵ）浓度为40mg／L 或60mg／L 的溶液，考察混合菌株对Cr（Ⅵ）的去除效应，其试验结果见图5至图6。

由图5 可知：两个试验组的组合对40 mg／L Cr（Ⅵ）溶液中的Cr（Ⅵ）均有较好的去除效果，在60 h时其去除率分别达到88%和98%左右；同图2相比，HB菌与XJ-Ⅱ菌组合对40mg／LCr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的去除率略小于HB 菌单独对40 mg／L Cr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的去除率，却远远大于XJ-Ⅱ菌单独对40mg／LCr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的去除率，这可能是固定化后对菌体的活力有损害，加上混合菌之间的协同作用共同作用的结果；HB菌与Ua菌组合大于单一菌株对40 mg／LCr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的去除率，这可能是由于HB 菌与Ua菌组合的协同作用稍大于HB 菌与XJ-Ⅱ菌组合，去除固定化后菌体的活力损伤，但仍可得到较高的Cr（Ⅵ）的去除率。说明固定化后对Cr（Ⅵ）的去除率不仅与混合菌之间的协同作用有关，还可能与菌体固定化后活力损失有关。经固定化后活力损失较小且具有较高协同作用的混合菌体，对低浓度Cr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的去除率不仅不会降低，还可解决游离微生物处理Cr（Ⅵ）的缺陷，即耐毒害能力较弱、菌种流失较多、不具有可重复操作性、后期处理不易等缺陷。

由图6 可知：两个试验组的组合对60 mg／L Cr（Ⅵ）溶液中的Cr（Ⅵ）在60h时的去除率差异不显著，分别为75%和70%左右；同图2相比，两个组合对60mg／LCr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的去除率高于单一菌株Ua菌和XJ-Ⅱ菌对40mg／LCr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的去除率，略低于HB 菌对60 mg／L Cr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的去除率，这可能是固定化后菌体的活力有损害、混合菌之间的协同作用以及40 mg／L Cr（Ⅵ）溶液对HB菌有促进作用而60mg／L Cr（Ⅵ）溶液对HB 菌有抑制作用共同作用的结果。此外，相同条件下还进行了固定化混合微生物技术对80mg／LCr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的去除效应研究，结果表明两个组合对80 mg／LCr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的去除率趋势同图6相似，说明具有协同作用的菌体固定化后，对较高浓度Cr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的去除率略微降低，但仍可达到较好的去除效果。

综上可知，混合菌株经固定化处理后对Cr（Ⅵ）的去除率与游离菌对Cr（Ⅵ）的去除率相同或略微降低，但仍可以达到较高的去除率，最高可达98%以上。由于固定化技术解决了游离菌不易分离、后期处理不易等缺陷，并且在其他行业已有实施案例，因此固定化混合微生物对Cr（Ⅵ）的去除在实际生产中是可行的。

3 结论

本文从混合微生物种类和固定化技术等方面对Cr（Ⅵ）的微生物去除效应进行了研究，得到如下结论：

（1）HB菌的耐受性和对Cr（Ⅵ）的去除率在3种菌株中是最好的，在40 mg／LCr（Ⅵ）溶液中OD600值可达4.6，对Cr（Ⅵ）的去除率可达98%左右，其次是Ua菌，最后是XJ-Ⅱ菌。

（2）混合菌株组合中，HB 菌与Ua菌组合和HB菌与XJ-Ⅱ菌组合均表现出协同作用。其中HB菌与Ua菌组合的OD600值和对Cr（Ⅵ）的去除率更高，在60 mg／LCr（Ⅵ）溶液中分别为4.7 和92%。

（3）混合菌株经固定化处理后，HB菌与Ua菌组合对Cr（Ⅵ）的去除率较高，在40mg／LCr（Ⅵ）溶液中其去除率可达到98%以上。

［1］Ziagova M G，Koukkou A I，Liakopoulou-Kyriakides M.Optimization of cultural conditions of Arthrobacter sp.Sphe3 for growth-associated chromate（VI）reduction in free and immobilized cell systems［J］.Chemosphere，2014，59：535-540.

［2］赵静.微生物法处理含铬电镀废水的试验研究［D］.广州：华南理工大学，2010.

［3］肖伟，王磊，张思维，等.六价铬还原细菌Bacillus cereus S5.4的筛选鉴定及还原特性研究［J］.工业微生物，2007，37（6）：1-6.

［4］He B Y，Yin H.Improvement of chromium biosorption through protoplast electrofusion between Candida tropicalis and Candida lipolytica［J］.Journal of Central South University，2012，19：1693-1701.

［5］Khezami L，Capart R.Removal of chromium（Ⅵ）from aqueous solution by activated carbons：Kinetic and equilibrium studies［J］.Journal of Hazardous Materials，2005，123：223-231.

［6］Field E，Gerlach K，Viamajala R，et al.Hexavalent chromium reduction by Cellulomonas sp.strain ES6：The influence of carbon source，iron minerals，and electron shuttling compounds［J］.Biodegradation，2013，24：437-450.

［7］Ramos R，Jacome L，Barron J，et al.Adsorption of zinc（XJ-Ⅱ）from an aqueous solution onto activated carbon［J］.Journal of Hazardour Materials，2002，90（1）：27-38.

［8］吴继明，程胜高.二氧化硫还原法处理含铬废水最佳工艺条件研究［J］.安全与环境工程，2014，21（5）：89-93.

［9］蒋艳红，刘咪咪，邱明达，等.海泡石、炉渣、改性钢渣吸附处理垃圾渗滤液中Cr（Ⅵ）的对比研究［J］.安全与环境工程，2012，19（1）：35-37.

［10］刘有才，钟宏，刘洪萍.重金属废水处理技术研究现状与发展趋势［J］.广东化工，2005，4：36-39.

［11］曹玉娟，张扬，夏军，等.ε-聚赖氨酸生产废菌体对六价铬吸附影响的研究［J］.环境科学，2012，33（2）：499-504.

［12］Pires C，Marques A，Magan N，et al.Removal of heavy metals using different polymer matrixes as support for bacterial immobilization［J］.Journal of Hazardous Materials，2011，191：277-286.

［13］刘建红，王雷荣.海藻酸钠、聚乙烯醇包埋固定化技术对紫色非硫光合细菌脱氢酶活性影响的试验研究［J］.安全与环境工程，2009，16（3）：54-56.

［14］杨文武，张钧.水和废水中Cr（Ⅵ）溶液测定关键问题研究［J］.环境工程，2010，28（3）：108-112.

［15］张慧.微生物对重金属铬离子吸附的实验研究［D］.湘潭：湘潭大学，2002.

［16］金科，李小明，杨麒，等.黄孢原毛平革菌吸附六价铬的研究［J］.工业安全与环保，2006，32（7）：9-12.

［17］何丽媛，党志，唐霞，等.混合菌对原油的降解及其降解性能的研究［J］.环境科学学报，2010，30（6）：1220-1227.

［18］陈丽华，马金珠，雒晓芳，等.添加混合菌剂对石油污染土壤的降解［J］.中南大学学报（自然科学版），2012，43（11）：4581-4589.