链霉素废水对斑马鱼POD 活性和GSH 含量的影响

2015-12-05曹志会周可心沈洪艳

安全与环境工程 2015年3期

李敏，赵月，曹志会，王冰，周可心，沈洪艳

（1.河北科技大学环境科学与工程学院，河北石家庄 050080；2.河北省药用分子化学实验室，河北石家庄 050080）

链霉素废水COD 浓度高，成分复杂，碳氮比偏低，含有较多的甲醛、草酸等生化抑制物质，可生化性差［1-2］。目前处理抗生素废水的技术主要有物化处理技术、好氧生物处理技术、厌氧生物处理技术和厌氧-好氧组合处理技术。如潘碌亭等［3］采用水解酸化-改良SBR（MSBR）-强化絮凝组合工艺处理某制药工业区废水，结果表明该处理工艺对废水中COD、BOD5和氨氮的去除率分别为80%、90%和82%；Chen等［4］采用UASB 处理高浓度6-APA 和青霉素混合废水，结果表明UASB反应器对废水中COD、6-APA 和青霉素的去除率分别为52.2%、26.3%和21.6%。目前，制药企业污水处理厂和城市污水处理厂的污水处理工艺对制药废水中的污染物质去除仍不够彻底［5-7］。沈洪艳等［8］采用暴露试验法研究了青霉素、土霉素混合废水的出水不同暴露浓度对斑马鱼肌肉组织中超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的影响，结果表明该废水对斑马鱼机体造成了一定的氧化损伤；此外，她还研究了链霉素废水对锦鲤鱼抗氧化酶和MDA 含量的影响，结果表明锦鲤鱼长期暴露于链霉素废水中会对其抗氧化防御系统及抗氧化能力产生影响［9］。因此，研究链霉素废水对斑马鱼是否具有生物毒性以及毒性水平具有重要的实际意义，并且可以为制药废水处理技术的效果评估提供毒理学依据。

斑马鱼（Danio rerio）属于鲤科鲐属淡水鱼，已成为国际标准化组织推荐的模式生物，在基因胚胎［10-12］等领域得到了广泛的应用。本文选用斑马鱼为模式生物，通过对其抗氧化指标的测试，研究链霉素废水对斑马鱼的毒性作用及毒性效应，旨在为环境中链霉素废水污染监测指标提供理论依据。

过氧化物酶（POD）存在于真核生物细胞的过氧化物酶体中，以铁卟啉为辅基，能催化过氧化氢氧化酚类，产物为醌类化合物，并且能够调节氧含量，使细胞免受高浓度氧毒害［13］。还原型谷胱甘肽（GSH）是一种低分子清除剂，也是动物体内重要的水溶性抗氧化剂，它在组织细胞代谢过程中有多种生理功能，概括起来主要有两个方面：一是解毒及细胞保护功能；二是抗自由基和抗氧化应激功能。GSH 是保护机体组织细胞使其避免氧化机制及自由基攻击的一种极其重要的氧自由基清除剂。有研究表明，细胞内自由基的水平及其代谢状况决定着细胞的生死存亡［14］。POD 和GSH 作为清除自由基的两种重要的抗氧化物质，其受应激后的变化可以间接反映这种危害的强弱。已有研究表明，机体抗氧化酶活性的变化（升高或降低）表示机体内活性氧的大量增加，并已扰乱机体抗氧化防御系统的正常功能［15］。

为了解链霉素废水在处理前对水生生物的毒性效应，本文采用某链霉素生产企业的废水进行斑马鱼暴露试验，测定斑马鱼的抗氧化指标，从而确定链霉素废水对斑马鱼是否具有毒性效应及其效应影响程度。

1 材料与方法

1.1 试验仪器和试剂

试验仪器：UV-2550 型紫外可见分光光度计（岛津公司）；DK-S26型恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；TG16-WS 台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；JPBJ-608型便携式溶解氧测定仪（上海精密科学与仪器有限公司）；EL204型电子分析天平（梅特勒-上海托利多有限公司）；FE20 型pH 计（梅特勒-上海托利多有限公司）；XK96-B型快速混匀器；SYZ-A 型石英亚沸高纯水蒸馏器；微量移液器若干；玻璃组织匀浆器若干；微型温度计和水硬度计（WAD-TH）等。

试验试剂：POD、GSH 和考马斯亮兰试剂盒，均购于南京建成生物工程研究所。蛋白含量采用考马斯亮兰蛋白试剂盒测试；GSH 含量和POD 活性均采用GSH、PCD 试剂盒测试。通常将在37 ℃条件下，每毫克组织蛋白每分钟催化产生1μg底物的酶量定义为一个过氧化物酶活力单位。

1.2 受试生物

选用斑马鱼（Danio rerio）为受试生物，由石家庄水产养殖基地提供，体长为（34.05±0.43）mm，体质量为（0.24±0.03）g，鱼苗经5%食盐水消毒后进入实验室。试验用水为曝气充氧除氯24h以上的自来水，水温维持在（27±1）℃，pH 值为6.5～7.5，溶解氧（DO）为5.0mg／L 以上，水质符合渔业水质标准，驯养期间斑马鱼死亡率小于4%。为防止饵料的影响，试验前24h停止喂食，并在整个亚急性毒性试验期间不喂食。

1.3 亚急性毒性试验方法

试验设定亚急性毒性试验浓度分别为10%、30%、50%和70%，研究不同暴露浓度的链霉素生产废水进水对斑马鱼的氧化损伤情况。试验分别设置1个空白组和4个试验组，每个试验组设置3个平行组，试验时间为15d。试验方法为：在5L鱼缸中分别放入4L的试验液，充分混合曝气后，将驯养的斑马鱼随机放入各试验组中，每组投放20尾鱼，并进行连续曝气；每天至少测定1 次试验液中的DO、pH 值、硬度和水温；采用静态置换法，每天换水，分别于第3、6、9、12和15天测定斑马鱼肌肉组织中POD 活性和GSH 含量。

1.4 样品处理

每次从相应的试验组中取5尾试验鱼，解剖，取其肌肉组织，在冰冷的0.86%生理盐水中漂洗，滤纸拭干，准确称取组织重量后，放入玻璃匀浆管中；用移液器按1∶9重量体积比（w／v）量取预冷的0.86%生理盐水，加入到匀浆管中进行匀浆，匀浆过程在冰水浴中进行，充分研磨约8min，制得10%组织匀浆；将制备好的匀浆液用普通离心机在3 000r／min下离心10min，取其上清液保存于4℃冰箱中。

1.5 试验条件

试验中所用废水来自链霉素生产过程中的提炼工段。试验用水pH 值约为7.5，总硬度约为100 mg／L，温度为22～24℃，DO 不低于5mg／L。试验期间用曝气装置连续曝气，为了保证鱼缸内链霉素废水进水浓度不变，每隔24h换试验液1次，每天至少测定1次试验液的水温、硬度、pH 值和DO 含量。

1.6 数据处理

试验结果用平均值±标准差表示。采用Excel软件T 检验法进行空白组和试验组的显著性分析，即：p＞0.05时，差异不显著；0.01＜p＜0.05时，差异显著；p＜0.01时，差异极显著。

2 结果与讨论

2.1 亚急性毒性试验结果

2.1.1 链霉素生产废水对斑马鱼肌肉组织中POD活性的影响

不同浓度链霉素生产废水对斑马鱼肌肉组织中POD 活性的影响试验结果见图1。

由图1可见，不同体积百分比的链霉素生产废水对斑马鱼肌肉组织中POD 活性的影响不同：10%体积百分比试验组的斑马鱼肌肉组织中POD 活性在第3天时被抑制（p＜0.01），第6～12天时POD活性一直处于显著诱导阶段（0.01＜p＜0.05），但是诱导效应逐渐降低，在第15天时POD 活性受到显著的抑制作用（0.01＜p＜0.05）；30%体积百分比试验组的斑马鱼肌肉组织中POD 活性在初期（第3～9天）始终处于轻度抑制阶段，无显著性，到了第12天时POD 活性表现出极显著性诱导（p＜0.01），此时斑马鱼体内POD 活性达到最大值（3.999 6 U／mgprot），且POD 活性的合成达到了最大值，对链霉素废水所引起的氧化损伤的清除能力达到最大，第15天时POD 活性大小又恢复至对照组水平；50%体积百分比试验组的斑马鱼肌肉组织中POD活性在第3天时呈现出显著性的抑制作用（0.01＜p＜0.05），第6 天时POD 活性受到显著诱导（0.01＜p＜0.05），第9天时POD 活性被显著抑制（0.01＜p＜0.05），第12 天时POD 活性出现上升趋势，到了第15 天POD 活性再一次被显著抑制（0.01＜p＜0.05）；70%体积百分比试验组的斑马鱼肌肉组织中POD 活性第3天被诱导升高，与对照组相比，其增幅为38.87%，第6 天时POD 活性诱导效应达到极大值（3.900 0 U／mgprot）（p ＜0.01），在第9天时POD 活性开始被抑制，表现出极显著性抑制效应（p＜0.01），在试验的中后期（9～15天），斑马鱼肌肉组织中POD 活性持续被抑制，在第15天时POD 活性达到了所有浓度组的最小值（0.800 0U／mgprot）。

2.1.2 链霉素生产废水对斑马鱼肌肉组织中GSH含量的影响

不同浓度链霉素生产废水对斑马鱼肌肉组织中GSH 含量的影响试验结果见图2。

由图2可见，10%体积百分比试验组的斑马鱼肌肉组织中GSH 含量在暴露的初期（第3～6 天）被抑制（p ＜0.01），第9 天时GSH 含量升高（0.01＜p＜0.05），但在暴露的后期（第12～15天）GSH 含量由诱导转变为显著性抑制效应（0.01＜p＜0.05），与第9天相比，斑马鱼肌肉组织中GSH含量下降，其降幅分别为52.67%和50.24%；30%体积百分比试验组的斑马鱼肌肉组织中GSH 含量在第3天时显著性被抑制（0.01＜p＜0.05），第6天时出现极显著性抑制作用（p＜0.01），到第9 天时GSH 含量急剧升高，出现极显著诱导（p＜0.01），第12天时GSH 含量急剧下降，呈现显著抑制效应（0.01＜p＜0.05），与第9天相比，斑马鱼肌肉GSH含量下降，其降幅为64.43%，第15天时GSH 含量再一次升高，被极显著性诱导（p＜0.01），此时斑马鱼肌肉组织中GSH 含量达到最大值13.009 5 mgGSH／gprot，与第 12 天相比，其升幅为220.50%；50%体积百分比试验组的斑马鱼肌肉组织中GSH 含量在第3天时与空白组相比表现出极显著诱导效应（p＜0.01），第6天时GSH 含量开始降低，直至第9 天期间GSH 含量均处于极显著性抑制阶段（p＜0.01），暴露后期（第12～15天）GSH含量呈现出极显著的诱导效应（p＜0.01）；70%体积百分比试验组的斑马鱼肌肉组织中GSH 含量在第3天时受到显著诱导作用（0.01＜p＜0.05），第6天时开始直至暴露试验结束（第6～15天）GSH 含量一直被抑制，呈现出极显著抑制作用（p＜0.01）。

2.2 亚急性毒性试验结果分析与讨论

2.2.1 链霉素废水对斑马鱼肌肉组织中POD 活性的影响分析

当生物体受到外源性污染物进攻时会产生大量活性氧自由基，活性氧自由基若不及时被清除，就会引起DNA 断裂、脂质过氧化、酶失活等损伤，对生物机体造成氧化胁迫［16］。斑马鱼暴露在链霉素废水中，低浓度组（10%体积百分比）废水中斑马鱼肌肉组织中POD 活性出现抑制—诱导—抑制的变化趋势。分析其原因认为是：当斑马鱼受到链霉素废水胁迫，体内的抗氧化防御平衡系统被打破，POD活性受抑制，随着鱼体内超氧阴离子自由基浓度的增加，POD 活性被激活，并通过活性升高来清除H2O2，使机体免受氧化损伤和毒害；随着暴露时间的增加，POD 不断被消耗，到后期（第15天）时POD活性会下降，这与宋志慧等［17］关于Cu2+、Cd2+、Cr6+胁迫对斑马鱼POD 活性影响的研究结果一致。中浓度组（30%和50%体积百分比）废水中斑马鱼肌肉组织中POD 活性基本维持在对照组水平，说明中浓度组链霉素废水对斑马鱼肌肉组织造成的氧化性损伤能够通过自身调节使其达到氧化—抗氧化平衡。高浓度组（70%体积百分比）废水对斑马鱼的毒害作用比较明显，表现出显著诱导—抑制的趋势，且对POD 活性的抑制效应更为明显，POD 活性初期被诱导，说明斑马鱼受到胁迫后产生应激效应，POD 活性上升抵制外界不利干扰，从第9天开始直至试验结束（第15天）斑马鱼肌肉组织中POD 活性一直处于被抑制阶段，说明链霉素废水中污染物质的浓度高，其侵扰对鱼体抗氧化系统产生严重干扰，POD 活性不足以消除污染物质的干扰，其产生和消除平衡被打破，鱼体内活性氧自由基浓度超过了POD 的消除能力，此时斑马鱼消除活性氧自由基机制严重失衡，POD 活性急剧下降，斑马鱼遭到了氧化损伤。可见，70%体积百分比的链霉素废水可使斑马鱼POD 失活。

2.2.2 链霉素废水对斑马鱼肌肉组织中GSH 含量的影响分析

斑马鱼暴露于10%体积百分比的链霉素废水中，斑马鱼肌肉组织中GSH 含量出现抑制—诱导—抑制的趋势。暴露初期GSH 含量下降，说明链霉素废水对斑马鱼肝脏具有一定的毒害作用；在第9 天时斑马鱼体内的GSH 含量表现出诱导作用，原因可能是废水的毒害作用未达到肝脏可承受的极限，GSH 通过含量升高来消除活性氧自由基，保持体内自由基的平衡，这与马晓燕等［18］关于三丁基锡（TBT）对罗非鱼GSH 的影响研究结果一致；随着暴露时间的增加，斑马鱼体内活性氧自由基数量的增多，对斑马鱼造成了氧化性损伤，使GSH 含量表现为抑制状态。斑马鱼暴露于30%体积百分比的链霉素废水中，斑马鱼肌肉组织中GSH 含量变化表现出抑制—诱导—抑制—诱导趋势。刚开始表现为抑制作用，与10%浓度组的结果一致，说明斑马鱼GSH 应激性较缓慢；随着暴露时间的增加，链霉素废水中污染物进入鱼体的数量增加，诱导GSH 的合成来为自身解毒；在第12天时GSH 含量又表现出抑制作用，说明GSH 含量已不足以消除过多的阴离子氧自由基；但是试验后期（第15 天）GSH 含量又表现为诱导作用，说明机体抗氧化防御系统还在发挥清除自由基的作用，这表明暴露于30%体积百分比的链霉素废水中斑马鱼的抗氧化防御系统仍然具有清除抗氧自由基的能力，可以通过GSH 含量的变化应对体内活性氧自由基的增多，抵御外界污染胁迫。吴志刚等［19］在青土霉素废水出水对锦鲤肝脏抗氧化酶活性和丙二醛含量的影响研究、杨森等［20］在四环素类药物抗氧自由基作用的研究也出现类似的现象。暴露在50%体积百分比的链霉素废水中，斑马鱼肌肉组织中GSH 含量呈现诱导—抑制—诱导的变化趋势。在后期（第12～15天）GSH 含量仍然是诱导趋势，表明此时的污染胁迫水平尚未达到斑马鱼抗氧化系统的阈值，其氧化性损伤是可修复的。但70%体积百分比的链霉素废水则对斑马鱼的毒害作用较明显，暴露期间斑马鱼肌肉组织中GSH 含量呈现出诱导—抑制的趋势，在第15 天时GSH 含量被抑制的趋势没有改变。高浓度组（70%体积百分比）的链霉素废水使斑马鱼快速进入应激阶段，GSH 含量快速升高以消除鱼体内活性氧自由基对肝脏的毒害，但是随着暴露时间的增加，链霉素废水对斑马鱼的毒害超过了斑马鱼可承受的范围，GSH 含量消耗过多且急剧下降，表明高浓度链霉素废水对斑马鱼的伤害较大。斑马鱼肌肉组织中GSH 含量在试验中后期（第6～15天）均没有出现上升的趋势，说明70%体积百分比以上的链霉素废水对斑马鱼可造成严重的氧化损伤，使GSH 失活。

3 结论

选用斑马鱼（Danio rerio）为受试生物，通过亚急性毒性试验，考察不同体积百分比的链霉素生产废水对斑马鱼肌肉组织中POD 活性和GSH 含量的影响，得到如下结论：

（1）斑马鱼暴露在10%体积百分比的链霉素废水中15d，其肌肉组织中POD 活性和GSH 含量变化呈现出抑制—诱导—抑制的变化趋势，说明斑马鱼已受到污染胁迫并有了应激反应。

（2）斑马鱼暴露在70%体积百分比的链霉素废水中15d，在试验后期（第9～15天）斑马鱼肌肉组织中POD 活性和GSH 含量都处于抑制状态，说明70%体积百分比的链霉素废水对斑马鱼的污染侵害超过了斑马鱼抗氧化防御体系可承受的范围，其氧化-抗氧化平衡状态被破坏，鱼体已受到较大的氧化损伤。

（3）比较斑马鱼两个生化指标POD 活性和GSH 含量发现，暴露期间两个指标变化趋势具有协同性，均可以表明斑马鱼已受到污染胁迫并产生应激反应。但斑马鱼暴露在10%～70%体积百分比的链霉素生产废水中15d，其肌肉组织中POD 活性不如GSH 含量敏感。

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