不同中医证型尖锐湿疣患者外周血及疣体组织中TLR3、TLR7 mRNA表达变化及意义

杨永茂，贾梅，杨桂兰，沈敏娟，高雯

（1内蒙古巴彦淖尔市医院，内蒙古巴彦淖尔 015000;2兰州军区兰州总医院;3吴江市第一人民医院）

尖锐湿疣（CA）是由人乳头瘤病毒（HPV）引起的外生殖器黏膜部位的增生性病变。大量研究［1］证明，CA的发生及转归与机体的免疫状态关系密切。2006年6月～2008年7月，我们观察了不同中医证型CA外周血及疣体组织中Toll样受体3（TLR3）、Toll样受体7（TLR7）mRNA变化，并探讨其意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择兰州军区兰州总医院收治的CA患者 30例，男 19例，女 11例;年龄 20～50（32.40±5.62）岁;病程 3 ～6（3.89 ±1.25）个月。纳入标准:CA临床诊断明确（疣体典型，呈菜花样、乳头样或鸡冠样），疣体≥黄豆大，1个或多个，醋酸白试验阳性，年龄18～60岁，无其他系统性疾病或急慢性皮肤病，病史3个月以上，3周内未用其他治疗CA的内服及外用药物，女性患者排除怀孕、哺乳及月经期。中医通过辩证论治分为Ⅰ型湿热蕴结型（病程较短，表面潮红，糜烂，渗液，伴心烦，口苦，小便黄，大便干结或不畅，舌质红，苔黄腻，脉滑数）16例和Ⅱ型正虚邪恋型（病程较长，病情屡治屡发，久治不愈，伴神疲乏力，纳呆，舌体胖淡，脉象沉细）14例。对符合上述入选标准者详细记录病史资料，行血常规检查，然后自肘静脉抽取血5 mL，加入肝素抗凝管1管（3 mL分离单个核细胞）;之后按常规切取100 mg的疣体组织，迅速置液氮中冷冻后转存至-70℃冰箱保存。另选30例作为对照（C组，男性来自泌尿外科包皮环切患者，女性为美容手术者）。

1.2 外周血及疣体组织TLR3、TLR7 mRNA检测在液氮中将疣体组织研磨呈细末状，淋巴细胞分离液分离外周血单一核细胞。采用TRIzol试剂，按说明书操作提取总RNA。按试剂说明书操作逆转录合成 cDNA，-70℃保存备用。目的片段引物:TLR3:5＇-GGACTTTGAGGCGGGTGTT-3＇，5＇-TGTTGAACTGCATGATGTACCTTGA-3＇，141 bp;TLR7:5＇-TCTTCAACCAGACCTCTACATTCCA-3＇，5＇-GGAACATCCAGAGTGACATCACAG-3＇，172 bp;β-肌动蛋白:5＇-CCGCCATGTAGGTCGCTAT-3＇，5＇-TGACACGCCATCACCAG-3＇。标准品选用正常对cDNA梯度稀释后获得（将cDNA的梯度换算为拷贝数，进行倍比稀释，即取10 μL cDNA加入90 μL双蒸水，混匀，依次类推，共稀释4个梯度）。实时荧光定量PCR检测:25 μL反应体系中含有上下游各1 μL（20 pmol/L），荧光染料0.5 μL（20 pmol/L），Taq 酶 0.3 μL（5 U），dNTPs 1 μL及cDNA 1 μL（20 pmol/L）。程序为95℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环，最后72℃延伸1 min，用含有4个梯度浓度的cDNA制备成标准曲线对标本进行定量。

1.3 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件。计量资料以±s表示，组间比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

各组外周血及疣体组织中TLR3、TLR7 mRNA比较见表1。

表1 各组外周血及疣体组织中TLR3、TLR7 mRNA比较（ ±s）

表1 各组外周血及疣体组织中TLR3、TLR7 mRNA比较（ ±s）

注:与 C 组比较，*P ＜0.05;与 B 组比较，△P ＜0.05。

TLR3 mRNA TLR7 mRNA组别 外周血 疣体组织A 组 2.85 ±0.23＊△ 3.06 ±0.21＊△ 2.49 ±0.13＊△ 2.71 ±0.14外周血 疣体组织＊△B 组 2.77 ±0.16* 2.96 ±0.19* 2.37 ±0.15* 2.74 ±0.16*C组1.45 ±0.31 1.78 ±1.19 1.50 ±0.29 1.87 ±1.43

3 讨论

CA属于中医“臊瘊”的范畴，气血不和，腠理不密，外邪侵袭，房事不洁，感受秽浊，邪毒与气血相搏，凝聚肌肤而成。如果未及时治疗或治疗不当，湿邪蕴久困脾，脾虚湿浊下注，酿湿生热，湿热交结，而致正气亏虚，不能驱邪外出，导致病程缠绵迁延，反复发作而又难以治愈。因此，将CA分为湿热蕴结型和正虚邪恋型来研究，符合 CA的发病机理［2，3］。CA患者感染HPV后宿主与病毒之间的相互较量最终决定病情的发展，TLR受体在免疫方面起重要作用，在CA患者存在TLR3和TLR7的高表达现象，通过与健康者比较，CA患者显著偏高，湿热型较正虚邪恋偏高，提示中医不同证型之间在微观方面有不同的变化，符合中医的辩证分型。

TLR受体是近年来发现的重要天然识别受体［4，5］，是一类重要的模式识别受体，在固有免疫和适应性免疫中发挥重要作用，在人类已发现至少12个家族成员，广泛分布在单核细胞、T细胞、血管内皮细胞、消化道上皮细胞、脂肪细胞、心肌细胞等细胞表面，与病毒识别有关的有 TLR3、TLR7、TLR8、TLR9，当病原微生物入侵时，机体通过识别外源性微生物的侵入，并激活免疫反应清除外来微生物［6～9］。TLR是迄今认识的第一组机体通过感知病原体直接作出防御反应的天然免疫受体，在先天性免疫激活及其与获得性免疫之间的信号传导中起重要作用，尤其在识别微生物时起关键作用，如TLR3能够识别双链RNA病毒，TLR7能识别单链RNA病毒［10］。机体的免疫反应包括两种机制，一种是由巨噬细胞和树突细胞（DC）承担的先天性免疫，另一种是由T、B细胞承担的获得性免疫。在病毒感染中，先天性免疫发挥着极其重要的防御作用。TLR能直接活化抗微生物应急防御系统，合成和分泌Ⅰ型干扰素，而Ⅰ型干扰素是目前抗病毒治疗的主要措施［7，11］。抗病毒药鸟苷类似物及免疫调节剂就是能通过TLR7激活DC，诱导不同的炎症性诱导因子产生，在临床上用来治疗包括CA在内的多种病毒性皮肤病。治疗CA的常用药物咪喹莫特就是通过TLR7介导Ⅰ型干扰素的生成，连接先天免疫和适应性免疫，从而发挥抗病毒效应［12，13］。

本研究显示，CA患者外周血及组织中TLR3、TLR7 mRNA均高于健康对照者，且湿热蕴结型高于正虚邪恋型，提示CA患者与健康人群比较，Toll受体积极参与人体免疫系统清除病毒;不同证型之间比较更进一步说明整体观的重要性，用微观的理论佐证宏观的辩证论治，也为CA中医辨证分型的客观化、微观化提供了理论依据，为CA发病机理方面提供了参考资料。

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