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HIV-1感染者PBMC中SAMHD1 mRNA表达变化及其与血浆IFN-α水平的相关性

2015-12-02饶和平金祥宁卢伟力彭晓蓉靳昌忠

山东医药 2015年23期
关键词:载量感染者干扰素

饶和平,金祥宁,卢伟力,彭晓蓉,靳昌忠

(1衢州职业技术学院医学院,浙江 衢州 324000;2金华职业技术学院医学院;3衢州市人民医院;4浙江大学医学院附属第一医院)

不育-α-基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白1(SAMHD1)是一种最新发现的HIV-1宿主限制因子,它高表达于髓系细胞,如树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞等,而在HIV-1容易感染的CD+4T 细胞中的表达却较低[1,2]。SAMHD1 是一种dGTP依赖的磷酸水解酶,能够将dNTPs水解成脱氧核苷和无机的三磷酸,从而降低细胞中dNTP水平,起到清除细胞内过剩的dNTPs的作用[3]。HIV-1感染细胞后,病毒RNA在逆转录酶的作用下形成病毒DNA,这时需要大量的dNTP,SAMHD1通过耗竭细胞内的dNTP使病毒的逆转录过程受阻,从而限制病毒的感染[4]。同时,SAMHD1也是目前已知惟一的HIV-1无法对抗的宿主限制因子。因此,SAMHD1的表达对HIV-1的感染及潜伏的形成十分重要。体外实验表明,SAMHD1的表达受干扰素 (IFN-α)调控,干扰素可以显著促进SAMHD1的表达[5]。HIV-1感染可以产生一系列的炎症反应和细胞因子的分泌,包括 IFN-α 水平的升高[6]。HIV-1 感染者 SAMHD1 mRNA的变化及其与IFN-α水平的关系目前尚未见报道。本研究观察了HIV-1感染者外周血单个核细胞(PBMC)中SAMHD1 mRNA,并分析了其与血浆IFN-α水平的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2014年5~10月于浙江大学附属第一医院就诊的HIV-1感染者78例,其中32例未接受抗病毒治疗,男22例,女10例;年龄(37.8±7.6)岁;46例接受高效抗逆转录病毒治疗(HAART)1 a以上,男33例、女13例,年龄(35.93±11.57)岁,治疗时间(3.1 ±1.2)a;所有 HIV-1 感染者均经初筛和确认试验HIV-1抗体阳性,近期无机会性感染或肿瘤以及HBV/HCV合并感染。另外招募正常对照者 28例,男21例、女7例,年龄(38.29±12.51)岁。各组一般资料无统计学差异,具有可比性。本研究得到浙江大学附属第一医院伦理委员会批准,所有研究方案均告知患者本人,并签订知情同意书。

1.2 PBMC中SAMHD1 mRNA检测 每位受试对象抽取EDTA抗凝血5 mL,用于PBMC分离、流式细胞术和病毒载量检测。采用密度梯度离心法(Ficoll淋巴细胞分离液)分离上述抗凝血,得到PBMC。用TRIzol溶液溶解上述细胞,按照说明书,提取总体RNA。取1 μL RNA,利用 PrimeSciptTM逆转试剂盒逆转录为cDNA。采用20 μL反应体系,取1 μL cDNA反应产物,加入SYBR定量检测混合试剂中,利用Light Cycler2.0定量PCR仪扩增、检测。反应条件:先在95℃反应30 s,再在95℃、5 s和60℃、20 s条件下反应40循环。利用2-ΔΔCt相对定量法计算SAMHD1 mRNA。

1.3 血浆 IFN-α 水平检测 采用人 IFN-α ELISA检测试剂盒检测血浆IFN-α水平,操作按照说明书所述步骤进行。

1.4 血浆HIV病毒载量检测 采用HIV-1 Monitor 1.5(Roche)商品化试剂盒,在COBAS Amplisemsor-PCR仪上对血浆样品的HIV-RNA作定量分析,操作严格按照试剂盒说明进行,结果以每毫升血浆含病毒拷贝数表示,最低检测限50拷贝/mL。

1.5 外周血CD+4、CD+8T细胞数检测 采用流式细胞仪和CD3/CD4/CD8三色标记单抗绝对定量试剂盒进行检测,取全血50 μL,用20 μL单克隆抗体混合物孵育1 h,用红细胞裂解液裂解红细胞之后上机检测。用System U软件进行分析。

1.6 统计学方法 采用SPSS15.0统计软件。计量资料以±s表示,组间比较采用t检验,采用单因素方差分析对多组数据进行统计学分析,其中两两比较采用LSD法。相关性分析采用Pearson相关分析法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组PBMC中 SAMHD1 mRNA及血浆 IFN-α水平比较 结果见表1。

表1 各组PBMC中SAMHD1 mRNA及血浆IFN-α水平比较( ± s)

表1 各组PBMC中SAMHD1 mRNA及血浆IFN-α水平比较( ± s)

注:与正常对照组比较,*P <0.01。

组别 n SAMHD1 mRNA IFN-α治疗组 46 1 278±276* 67.5±15.7*未治疗组 32 1 422±319* 51.6±10.3*正常对照组28 684±183 27.2± 9.1

2.2 各组血浆HIV病毒载量及外周血CD+4T细胞、CD+8T细胞数比较 结果见表2。

表2 各组血浆HIV病毒载量及外周血CD4+T细胞、CD8+T 细胞数比较(±s)

表2 各组血浆HIV病毒载量及外周血CD4+T细胞、CD8+T 细胞数比较(±s)

注:与未治疗组比较,*P <0.05;与正常对照组比较,△P <0.05。

组别 n 病毒载量(log10)CD+4T细胞数CD+8T细胞数(个/μL)(个/μL)治疗组 46 0.81 ±1.25* 452.05 ±161.20*△835.88 ±370.36未治疗组 32 4.44 ±0.93 325.17±188.83△ 1 056.81±523.02正常对照组28 - 693.52 ±148.26 983.46 ±508.94

2.3 相关性分析 HIV-1感染者PBMC中SAMHD1 mRNA与病毒载量、CD+4T细胞数量无相关性(r分别为 -0.306、0.064,P均 > 0.05),与血浆IFN-α 水平呈正相关(r=0.324,P<0.05)。

3 讨论

固有免疫和获得性免疫在抗HIV-1及其机会性感染中发挥了重要作用,特别是固有免疫,是近年来抗HIV-1感染免疫研究的热点。SAMHD1在固有免疫系统中扮演重要角色。SAMHD1功能的缺失可以造成细胞内dNTPs的大量积聚,从而引发强烈的免疫活化和大量的 Ⅰ 型干扰素分泌[7,8]。因此,SAMHD1这种通过清除过剩的dNTPs来减少核酸代谢引起的免疫活化的能力,使它与固有免疫反应紧密地联系起来,又被形象地称为“IFN反应的负性调节器”[7,9]。SAMHD1 对固有免疫应答的调控在HIV-1感染中的作用尚不清楚。一方面,SAMHD1对Ⅰ型干扰素分泌的抑制作用可能促进HIV-1的感染;另一方面,SAMHD1通过避免免疫系统过度活化以减少CD+4T细胞的活化和HIV-1的感染。此外,SAMHD1还是HIV-1感染的重要宿主限制因子。HIV-1难以有效感染DC、单核细胞、巨噬细胞等髓系细胞的主要原因是这些髓系细胞高表达SAMHD1[4,10]。敲除 SAMHD1 基因后,这些髓系细胞就丧失了对HIV-1感染的抵抗性,可以被HIV-1大量感染[11]。SAMHD1对HIV-1感染的限制是通过降低HIV-1逆转录所需的原料dNTPs的浓度来实现的[12]。SAMHD1基因缺陷的AGS患者的单核细胞更容易感染HIV-1,进一步在人体原代细胞上验证了 SAMHD1 的 HIV-1 感染限制功能[13,14]。

SAMHD1在固有免疫调控及HIV-1感染中的重要作用。本研究显示,HIV-1感染者PBMC中SAMHD1表达及 IFN-α水平升高,SAMHD1表达与IFN-α水平呈正相关,而与CD+4T细胞数量和病毒载量无关。SAMHD1在抑制Ⅰ型干扰素过度分泌的同时,其自身的表达又受干扰素的调控。SAMHD1最初是作为一种IFN-γ诱导的蛋白被发现的[15]。此外,有报道[16]IFN-α 也可以诱导 SAMHD1的表达。我们在前期研究中发现,IFN-γ可以在 THP-1和Jurkat细胞上诱导SAMHD1的表达[17]。这样,SAMHD1与干扰素形成了一个互相调控的复杂网络。Buitendijk等在研究Toll样受体(TLRs)的免疫应答时发现,TLR9活化时伴有SAMHD1表达的升高。结合TLRs在病毒感染免疫应答中的重要作用,HIV-1感染是否可以通过TLRs通路调控SAMHD1?本研究结果提示,HIV-1感染上调SAMHD1表达的机制可能是通过IFN-α的调节实现的。HIV-1感染靶细胞后,可以通过与Toll样受体结合,促进IFN-α以及多种促炎因子的表达,而IFN-α水平的升高又可以上调SAMHD1的表达,来抑制免疫系统的过度激活,同时抑制HIV-1感染新的靶细胞。

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