原发性失眠患者血清炎性因子水平、PBMC中NF-κB表达、外周血免疫细胞计数变化及意义

王志伟，汪青松

（1安徽医科大学解放军临床学院，合肥 230000;2解放军第105医院）

原发性失眠是临床常见睡眠障碍，对个人的生理、心理造成了严重的伤害，同时给社会造成巨大的经济及医疗负担［1］。原发性失眠的发病机制目前尚不明确，其与机体免疫功能之间的关系仍知之甚少。大量研究发现，睡眠缺失可以导致机体内免疫机能及炎性反应的变化，但是实验对象主要是健康成年人，而采用睡眠剥夺实验来模拟日常慢性失眠患者病理生理变化很难完全反映原发性失眠患者体内相应的变化［2，3］。2013年9月 ～2014年9月，我们观察了原发性失眠患者血清IL-2、IL-6及外周血单个核细胞（PBMC）中核转录因子κB（NF-κB）和外周血免疫细胞计数变化，并探讨其意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 原发性失眠患者38例（观察组），男16例，女22例;平均年龄43.76岁，平均受教育年限12 a。纳入标准:受试对象年龄18～55岁。均符合美国《精神障碍诊断和统计手册》第四版（DSM-IV）失眠的诊断标准，且排除其他情况伴发的失眠。另选42例健康体检者（对照组），男20例，女22例;平均年龄42.04岁，平均受教育年限12 a。纳入标准:a.没有对失眠的主诉;b.通常睡眠持续在7～9 h。排除标准:受试者必须排除下列因素的干扰:a.其他类型的睡眠障碍（如睡眠呼吸暂停综合征、周期性肢体不宁腿综合征等）;b.有以下慢性精神性疾病，如抑郁症、焦虑症、精神类物质依赖等;c.可能会影响睡眠或免疫系统的急性或者慢性疾病（如肿瘤、心脑血管疾病、自体免疫性疾病等）;d.最近2周未服用能影响睡眠结构和免疫功能的药物（如治疗精神类疾病的药物、降血压药物、抗炎症类药物等）;e.受孕的妇女。

1.2 血清IL-2、IL-6检测 采用ELISA法。将所有试剂从冰箱内取出，放置于室温下（18～25℃）并充分混匀，浓缩洗涤液加20倍蒸馏水稀释，充分混匀。冻干标准品按要求稀释，用前1 h配制，并充分混匀。IL-2、IL-6测定:分别取出IL-2、IL-6反应板加入10 μL 标准品（Standars）、已稀释血清 1 μL 于相应反应孔中。每孔分别加入50 μL Anti IL-2 Biotin/50 μL Anti IL-6 Biotin 和 50 μL Anti IL-2 POD/50 μL Anti IL-6 POD，轻轻混匀30 s，封住板孔，室温温育45 min。甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入350 μL洗涤液），并去除水滴（在厚迭吸水纸上拍干），反复洗涤 5次。再每孔加入100 μL显色液，轻轻混匀10 s，室温孵育。最后每孔加入100 μL终止液（Stop Solution）。轻轻混匀30 s;30 min内在450 nm处读取OD值。以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据血清样品的OD值可在标准曲线上查出其浓度。

1.3 单核细胞分离、核蛋白提取及NF-κB检测无菌条件下，抽取正常对照组和原发性失眠患者肘静脉血5 mL，均为空腹状态，置于肝素抗凝管中，轻轻混匀，立即进行下述实验。用等体积的 PBS（pH7.4）缓冲液稀释抗凝管中的血液，立即进行分离，充分混匀。室温下，将4 mL淋巴细胞分离液加入15 mL离心管，再将上述稀释的血液沿离心管壁缓缓平铺在淋巴细胞分离液面上层，使二液间界限分明。室温下以1 500 r/min离心15 min，吸取血浆和分离交接面白色云雾状单个核细胞层于另一15 mL无菌离心管中，得到的单个核细胞以5倍体积PBS液稀释，并充分混匀，室温下以1 000 r/min离心10 min，弃去上清液，轻轻弹起细胞沉淀，尽量去掉上清液，底层为单个核细胞。再用500 μL低渗缓冲液吹打细胞，移入预冷离心管，冰上孵育15 min，加25 μL 洗涤剂，高速振荡 10 s，低温微型离心机4℃ 30 s，将上清（细胞浆碎片）保存备用。50 μL完全裂解缓冲液内重悬细胞，高速振荡10 s，摇床，150 r/min，冰上孵育30 min，高速振荡30 s，低温微型离心机4℃、10 min，上清（核碎片）-80℃保存备用。核提取物蛋白浓度用Bradford法测定。按照试剂盒提供的说明书，按ELISA法检测NF-κB。

1.4 外周血免疫细胞计数 釆用Sysmex2100血细胞分析仪对采血当日的标本进行白细胞计数，操作按照说明书进行。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以±s表示，组间比较采用t检验。采用Spearman相关分析法分析血清 IL-2、IL-6水平及PBMC中NF-κB的相关性。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者血清 IL-2、IL-6水平及 PBMC中NF-κB表达比较 结果见表1。

表1 两组患者血清IL-2、IL-6水平及PBMC中NF-κB 表达比较（ ±s）

表1 两组患者血清IL-2、IL-6水平及PBMC中NF-κB 表达比较（ ±s）

注:与对照组比较，*P ＜0.05。

组别 n IL-2（ng/mL） IL-6（pg/mL）NF-κB（ng/mL）观察组 38 97.78 ±30.61* 6.05 ±2.01* 9.06 ±5.74*对照组42 77.82 ±35.85 4.45 ±2.18 4.21 ±2.29

2.2 观察组血清IL-2、IL-6水平及PBMC中NF-κB表达的相关性 观察组血清IL-2水平与IL-6水平呈正相关（r=0.529，P＜0.05），IL-2 水平与 NF-κB水平呈正相关（r=0.631，P＜0.05），IL-6 水平与NF-κB 水平呈正相关（r=0.809，P＜0.05）。

2.3 两组外周血白细胞、淋巴细胞、单核细胞计数比较 结果见表2。

表2 两组外周血白细胞、淋巴细胞、单核细胞计数比较（×109/L，±s）

表2 两组外周血白细胞、淋巴细胞、单核细胞计数比较（×109/L，±s）

注:与对照组比较，*P ＜0.05。

组别 n 白细胞 淋巴细胞 单核细胞观察组 38 7.01 ±3.43* 5.17 ±0.54* 0.60 ±0.21*对照组42 5.11 ±1.28 4.92 ±0.42 0.44 ±0.21

3 讨论

原发性失眠是临床上一种很常见的睡眠障碍。美国《精神障碍诊断和统计手册》第4版（DSM-IV）关于原发性失眠的诊断标准为睡眠启动困难和（或）睡眠维持困难或醒后体力、精力难以恢复，至少在1个月以上，引起社交及工作上的的苦恼，同时伴有工作及相关其他重要功能的损害;并排除以下疾病如慢性疼痛、慢性疾病、药物或物质依赖等引起的失眠。到目前为止，原发性失眠是临床上常见的睡眠障碍。慢性失眠的最主要的特征是睡眠启动及睡眠维持困难，以及睡眠对身体功能恢复作用的缺失。原发性失眠是很难治愈的一种疾病，目前我们对于失眠的临床机制及神经生物学方面的了解非常局限。有报道［4］显示，慢性失眠与下丘脑—垂体—肾上腺的节律性激活有关，并且失眠的严重性与下丘脑—垂体—肾上腺轴激活程度呈现正相关。

本研究发现，观察组血清IL-2水平高于对照组，提示失眠可以影响IL-2水平。其释放机制可能是原发性失眠神经系统去甲肾上腺素轴活性被激活后，肾上腺素释放因子导致了IL的分泌［5］。活化的NK细胞、单核细胞及淋巴细胞可以分泌IL，IL-2与不同的受体结合，产生的生物学效应不尽相同［6］。IL-2主要生理功能是促进炎症细胞的增殖反应，对炎症反应起到非常重要的作用［7］。研究［8］表明，给实验性兔蓝斑注射外源性IL-2，可以导致非快速眼动时程的延长，因此推断外源性IL-2对睡眠起到重要的调节作用。研究［9］发现，在夜间睡眠紊乱的情况下，IL-6较基础水平明显上升。除了慢性失眠，急性及慢性睡眠剥夺、慢性病痛、心理应激等同样可以导致IL-6分泌水平的增高［10］。体内单核细胞、神经胶质细胞可以分泌 IL-6，但主要由单核细胞分泌［11］。所以在探索睡眠及睡眠障碍相关疾病时，主要通过测量单核细胞分泌IL-6水平的改变。文献［12］报道，睡眠质量越差、睡眠时间越少，血清中IL-6水平越高。表明慢性睡眠缺失与IL-6水平密切相关。IL-2及IL-6作为细胞因子在免疫途径中起到至关重要的作用，同时，对睡眠的调节也起到非常重要的调节作用，相反睡眠的深度、时相也对其分泌产生重要的影响［13］。慢性失眠会导致人体慢性炎性反应及全身免疫功能的变化［14］。进一步提醒我们，IL-2及IL-6作为具有多种功能活性的炎症因子，通过其分泌水平的改变进而参与失眠对机体的调节。因而，对IL-2、IL-6与失眠患者之间更加深入的调节机制，对改善失眠患者的睡眠效率、质量及健康有着重要的研究价值。

本研究还发现，观察组PBMC中NF-κB水平高于对照组，且与血清IL-2、IL-6水平呈正相关。本实验观察到睡眠缺失导致细胞内NF-κB水平升高，证实了先前生物信息学的发现［15］，同时使人们了解到睡眠缺失是通过什么分子机制导致炎症的产生。研究［16］发现，急性精神应激导致去甲肾上腺素水平增高，去甲肾上腺素导致体内炎症标志物释放而进入血液中，同时也导致NF-κB的激活。同时有研究表明，生理上正常的去甲肾上腺素水平在体内能导致NF-κB 依赖性的活性激活［17］。

本实验通过观察长期慢性原发性失眠较睡眠正常健康人群对各种炎症指标及功能性白细胞的影响，因为日常生活中，原发性失眠远多于继发性失眠，所以我们只研究原发性失眠对免疫功能的影响。几乎所有的细胞学指标均有统计学上的改变。本研究显示，观察组白细胞、淋巴细胞、单核细胞计数高于对照组。说明了持续的、长久的睡眠抑制可能激活了人体的非特异性的免疫防御反应。因此，这些免疫细胞的增加，可能是由于长期的觉醒或者自我平衡睡眠驱动能力的增强，导致了免疫系统的激活，同时这可能是对免疫系统功能维持的一种适应性机制［18］。

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