喜树碱对HaCaT细胞低氧诱导因子1α表达的影响

张梁宇 王翔 陆亚琪 朱晓杨 陈扬

喜树碱对HaCaT细胞低氧诱导因子1α表达的影响

张梁宇 王翔 陆亚琪 朱晓杨 陈扬

目的 观察喜树碱对低氧（2%O2）培养下HaCaT细胞低氧诱导因子1α（HIF-1α）表达的影响，探讨外用喜树碱治疗银屑病可能的作用机制。方法 将HaCaT细胞分为实验组和溶媒组（对照组），实验组为喜树碱+DMEM培养液，终浓度分别为12.5、25、50、100、200 nmol/L；溶媒组为含二甲基亚砜（DMSO）的DMEM培养液。不同浓度的喜树碱作用于HaCaT细胞12、24、48、72 h，CCK8法检测细胞增殖；用以上浓度处理低氧诱导12 h的HaCaT细胞，Western印迹检测细胞HIF-1α蛋白的表达。将HaCaT细胞分为常氧组和低氧组，每组内再分喜树碱干预组（100 nmol/L）和非干预组（溶媒对照组），培养12 h后实时荧光定量PCR检测HIF-1α mRNA的相对表达。统计分析采用SPSS16.0软件进行Levene′s test、单因素方差分析、Dunnett-t检验和析因分析。结果 不同浓度喜树碱作用12、24、48、72 h后对HaCaT细胞的增殖有抑制作用，呈浓度和时间依赖关系；200 nmol/L喜树碱作用12 h，100、200 nmol/L喜树碱作用24 h细胞增殖抑制率分别为（17.66±6.46）%、（33.11±4.63）%、（56.31± 1.69）%，与同时段溶媒对照组间差异有统计学意义（均P＜ 0.05）。低氧诱导 12 h，25、50、100、200 nmol/L喜树碱处理后 HIF-1α蛋白表达分别为0.348±0.065、0.261±0.112、0.115±0.043、0.045±0.024，与溶媒组（1.445±0.329）比较，差异有统计学意义（均P＜0.05）。喜树碱干预（100 nmol/L）与非干预的HIF-1α mRNA表达（△Ct值）分别为：常氧组-5.575±0.29、-5.451±0.21；低氧组-6.543±0.57、-6.203±0.31；低氧较常氧条件下HaCaT细胞HIF-1α mRNA的表达下调，差异有统计学意义（F=29.856，P＜0.05）；喜树碱干预和非干预组间HaCaT细胞HIF-1α mRNA的表达在常氧和低氧条件下差异无统计学意义（F=1.667，P＞0.05）。结论 100 nmol/L喜树碱可抑制HaCaT细胞HIF-1α蛋白表达，对HIF-1α mRNA的表达水平无明显影响。

银屑病；喜树碱；缺氧诱导因子1；细胞低氧；HaCaT细胞

喜树碱是从我国特有的山茱萸珙桐科植物喜树树皮、树叶、树枝及果实中提取的一种生物碱，可靶向选择性抑制DNA拓扑异构酶I（topoisomerase，Topo I），阻碍DNA链的闭合，导致细胞DNA单链断裂、细胞死亡［1］。研究表明，喜树碱可抑制人HaCaT细胞端粒酶活性，抑制其增殖、诱导凋亡［2］，并在低氧模拟下能显著抑制HeLa和HEK293细胞系低氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）的表达［3］。本研究旨在观察喜树碱对低氧诱导HaCaT细胞HIF-1α表达的影响，探讨外用喜树碱治疗银屑病的可能作用机制。

资料与方法

一、材料及主要试剂

喜树碱（含量＞95%）为日本东京化成工业公司产品，4℃保存。HaCaT细胞系来源于第二军医大学长海医院中心实验室。二甲基亚砜（DMSO，美国Sigma-Aldrich公司），胰酶（以色列Bioind公司）、DMEM培养基（美国Coring公司），胎牛血清（德国PAN-Biotech GmbH公司），CCK8试剂盒（日本同仁化学公司），兔抗人HIF-1α单克隆抗体（美国Abcam公司）。PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

二、方法

1.细胞培养及低氧处理：HaCaT细胞用含10%FBS的DMEM培养基，在37℃、5%CO2的孵箱中培养，取对数生长期的细胞用于各项实验。预先设定低氧培养箱气体浓度为 2%O2、5%CO2、93%N2；氧浓度稳定为2%时，迅速将HaCaT细胞放入培养箱，待氧浓度重新稳定于2%后，培养12 h。

2.药物处理及分组：喜树碱以DMSO溶解后，-20℃避光保存，喜树碱储备浓度为5 g/L。使用时用DMEM培养液稀释成工作浓度，DMSO的终浓度≤0.1%。将HaCaT细胞分为实验组和溶媒组（对照组），实验组加喜树碱 +含 10%FBS的DMEM培养液，即喜树碱的终浓度分别为12.5、25、50、100、200 nmol/L；溶媒组为含 DMSO 的 DMEM 培养液（体积比为0.02∶100）。

3.CCK8检测细胞增殖抑制率：将对数生长期的HaCaT细胞（1×104/ml）接种于96孔板，每孔100 μl在 37 ℃、5%CO2的孵育箱中培养 24 h；去上清液，实验组每孔加入含一定浓度（12.5、25、50、100、200 nmol/L）喜树碱的 DMEM 培养基 100 μl，每一浓度设6个复孔，对照组加入含0.02 μl DMSO的DMEM培养液100 μl，空白组不加细胞，只加培养基。分别培养 12、24、48、72 h 后，每孔加入含 10 μl CCK8 溶液的无血清培养基 100 μl，37 ℃、5%CO2下孵育1 h，在酶标仪450 nm波长下测量各孔吸光值，细胞增殖抑制率=［1-（加药组各浓度平均吸光度值-空白组平均吸光度值）/（对照组平均吸收值-空白组平均吸光度值）］×100%。

4.Western印迹检测HIF-1α蛋白的表达：将对数生长期的HaCaT细胞（2×105/ml）接种于6孔板中，每孔2 ml，24 h后，弃上清液，实验组加入含有不同浓度（12.5、25、50、100、200 nmol/L）的喜树碱2 ml，对照组以等体积溶媒代替药物，同时放入低氧（2%O2）诱导箱中分别诱导12 h后，收集各组细胞，提取总蛋白。用BCA法定量试剂盒检测蛋白浓度：上样200 μg蛋白，10%SDS-PAGE电泳，转膜，5%的脱脂奶粉封闭2 h，加入兔抗人HIF-1α单克隆抗体（1∶1 000），4℃孵育过夜，TBST漂洗 3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶2 000）室温下结合2 h，洗膜5次后显色，凝胶成像仪显影。

5.实时定量RT-PCR检测HIF-1α mRNA的表达：实验分为常氧组和低氧组，每组内再分喜树碱干预组（100 nmol/L）和非干预组（溶媒对照组），处理时间均为12 h。收集各组细胞，采用Trizol一步法，常规方法提取RNA，按RT-PCR反转录试剂盒说明书要求进行反转录并建立PCR反应体系。各组均取1 μl cDNA作为PCR反应模板，加入SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（2×）10 μl及上、下游引物（浓度 5 μmol/L）各 1 μl，最后加无 DNsae-RNsae 水至总体积20 μl。PCR 反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸15 s，共 40个循环，于每个循环延伸段采集荧光信号。以β肌动蛋白为内参照，计算目的基因的相对定量△Ct及依此进行统计学分析。引物序列：HIF-1α上游引物5′-CCAGTTACGTTCCTTCGATCAGT-3′，下游引物 5′-TTTGAGGACTTGCGCTTTCA-3′。β肌动蛋白上游引物 5′-AGCCTCGCCTTTGCCGATCC-3′，下游引物5′-ACCATCACGCCCTGGTGCCT-3′。

6.统计学处理：实验重复3次，取均数。用SPSS16.0统计软件分析。计量资料以±s表示，用Levene检验方差齐性，方差不齐，进行对数转换；采用单因素方差分析进行组间比较。组内各实验组与溶媒组比较采用Dunnett-t检验。HIF-1α mRNA的表达采用析因设计的方差分析；P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、喜树碱对HaCaT细胞增殖抑制作用

与溶媒组比较，12.5、25、50、100、200 nmol/L 喜树碱作用 12、24、48、72 h对 HaCaT 细胞均有抑制作用，且与时间、浓度呈依赖关系。随着药物浓度的增加和作用时间的延长，喜树碱对HaCaT细胞的生长抑制率逐渐增高，见表1。

与溶媒组相比，200 nmol/L喜树碱作用12 h后就开始对HaCaT细胞的增殖有明显的抑制作用，一直到72 h该抑制作用仍很明显（P＜0.05）；100 nmol/L喜树碱作用24 h后开始产生明显的抑制作用，并且持续到72 h时，抑制作用仍然明显（P＜ 0.05）；50 nmol/L 喜树碱作用 48、72 h时对HaCaT细胞的增殖均有明显的抑制作用（P＜0.05）；25 nmol/L喜树碱作用72 h后才产生明显的抑制作用，差异有统计学意义（均P＜0.05）。喜树碱处理HaCaT细胞 24、48、72 h的半数抑制浓度（IC50）分别是 125.58、41.91、23.95 nmol/L。

二、喜树碱对低氧诱导HaCaT细胞HIF-1α蛋白表达影响

表1 不同浓度喜树碱在不同时间对HaCaT细胞增殖抑制率（%，±s）

表1 不同浓度喜树碱在不同时间对HaCaT细胞增殖抑制率（%，±s）

注：n=3。a：与同时段溶媒组比较，P＜0.05

组别（nmol/L） 12 h 24 h 48 h 72 h喜树碱12.5 nmol/L - 7.59±1.89 6.37±5.79 16.35±3.58 25 nmol/L 2.28±2.11 8.78±2.87 28.69±8.92 61.77±8.13a 50 nmol/L 4.79±5.62 17.11±6.56 57.08±7.88a79.50±7.54a 100 nmol/L 4.67±3.33 33.11±4.63a 85.03±5.31a93.78±3.12a 200 nmol/L 17.66±6.46a 56.31±1.69a 95.10±2.03a98.18±0.46a溶媒组 2.40±4.11 2.14±1.31 3.06±2.90 8.64±7.86

如图 1所示，不同浓度喜树碱（12.5、25、50、100、200 nmol/L）作用于低氧诱导（2%O2）的 HaCaT细胞12 h，HIF-1α蛋白的表达随喜树碱浓度的升高而下调，并在100、200 nmol/L喜树碱浓度下被明显抑制。经单因素方差分析，各浓度喜树碱对低氧诱导HaCaT细胞HIF-1α蛋白表达有差异（数据经对数转换后Levene检验显示方差齐性，P=0.126；F=31.527，P＜ 0.05）。组间多重比较显示，25、50、100、200 nmol/L喜树碱处理后HIF-1α表达（分别为0.348 ± 0.065、0.261 ± 0.112、0.115 ± 0.043、0.045 ±0.024）与溶媒组（1.445±0.329）比较，差异有统计学意义（均P＜0.05）。

图1 不同浓度喜树碱对低氧（2%O2）诱导12 h HaCaT细胞HIF-1α蛋白的表达

三、喜树碱对低氧诱导HaCaT细胞HIF-1α mRNA表达影响

100 nmol/L喜树碱对常氧和低氧条件下HaCaT细胞作用12 h后HIF-1α mRNA的表达水平与相应的对照组比较，差异无统计学意义（F=1.667，P＞0.05）。但低氧组与常氧组比较HIF-1α mRNA的表达量相对降低，差异有统计学意义（F=29.856，P＜0.05）。见表 2。

讨 论

HIF-1是一种氧依赖转录活因子，是细胞在缺氧条件下产生的转录活性核蛋白，由α亚基和β亚基组成异源二聚体，其活性形式为HIF-1α。寻常性斑块型银屑病皮损角质形成细胞过度增殖，可造成局部微环境缺氧。研究表明，银屑病皮损组织中HIF-1α的表达相对于特应性皮炎、脂溢性皮炎或正常皮肤组织均明显增加［4-5］，并可调控与银屑病皮损真皮乳头层血管增生相关的多种靶基因表达，如，血管内皮生长因子、环氧合酶2、诱导型一氧化氮合成酶、基质金属蛋白酶 2［6-8］。HIF-1α与葡萄糖转运蛋白1（GLUT-1）表达呈正相关，并可能参与银屑病角质形成细胞过度增殖角化不全［9］。因此本研究以低氧诱导的HaCaT细胞为模型，观察喜树碱对HIF-1α表达的影响。

本实验中，25、50、100、200 nmol/L 喜树碱均能抑制HaCaT细胞的增殖活性，随着药物浓度升高和作用时间延长，呈浓度和时间依赖关系。200、100、50、25 nmol/L 喜树碱分别于作用 12、24、48、72 h后开始对 HaCaT 细胞的增殖有明显的抑制作用，并且持续到72 h时（P＜0.05），而喜树碱作用 HaCaT 细胞 24、48、72 h 的半数抑制浓度（IC50）分别是 125.58、41.91、23.95 nmol/L。用 12.5、25、50、100、200 nmol/L 喜树碱处理低氧诱导12 h的HaCaT细胞，随着喜树碱浓度增加，对HIF-1α蛋白表达抑制作用也增强（图1），除12.5 nmol/L喜树碱外，其余4个浓度喜树碱对细胞HIF-1α蛋白表达与对照组间比较，差异有统计学意义（均P＜0.05）。以上结果均提示低浓度喜树碱可抑制HaCaT细胞增殖，抑制HIF-1α蛋白表达的药物浓度较增殖抑制浓度低。

表2 喜树碱对不同氧压条件处理的HaCaT细胞HIF-1α mRNA相对表达量的影响（±s）

表2 喜树碱对不同氧压条件处理的HaCaT细胞HIF-1α mRNA相对表达量的影响（±s）

注：n=3

组别 不同氧压条件常氧组（21%O2） 低氧组（2%O2）喜树碱100 nmol/L 0.021 297±0.004 252 0.011 549±0.005 569溶媒组 0.023 664±0.003 441 0.013 824±0.002 800

本实验低氧诱导12 h的HaCaT细胞HIF-1α mRNA表达较常氧组降低（P＜0.05），该现象可能与细胞急性缺氧有关，尚需对多个时间点进一步观察。Bosco等［10］观察到低氧诱导 16 h，人外周血单核细胞HIF-1α mRNA表达下降，认为可能存在负反馈调节机制。100 nmol/L浓度喜树碱作用低氧诱导的HaCaT细胞12h，细胞中HIF-1α蛋白表达被明显抑制，分别观察同一浓度和时间点喜树碱对常氧或低氧状态下HaCaT细胞HIF-1αmRNA表达的影响，发现HIF-1α mRNA在喜树碱干预前后的表达差异无统计学意义（P＞ 0.05）。Bertozzi等［3］以 0.5 μmol/L 喜树碱作用于去铁胺低氧模拟下的HeLa和HEK293细胞系，两种细胞系HIF-1α蛋白水平均被明显抑制，HeLa细胞系HIF-1α mRNA表达无明显变化，进一步实验发现抑制miR-17-5p、miR-155表达后，能影响喜树碱对HIF-1α蛋白表达的抑制，提示喜树碱是在转录后水平调节HIF-1α的表达。本研究结果表明，喜树碱对HaCaT细胞HIF-1α mRNA表达的调控也可能是转录后水平。

临床上，0.03%喜树碱软膏被推荐治疗慢性斑块型银屑病，疗效与0.02%丙酸氯倍他索霜相似［11］，其药理机制尚不清楚。文献［12］报道咪喹莫特诱导的银屑病鼠模型，氯倍他索可通过抑制IL-23/IL-17A炎症反应轴对小鼠皮损有治疗作用，但喜树碱对该炎症轴无明显抑制作用，不能有效治疗小鼠银屑病样皮损表皮增殖。喜树碱有较强的细胞毒性，对HaCaT细胞HIF-1α蛋白表达有明显抑制，喜树碱对慢性斑块状银屑病的治疗作用是否与调控HIF-1α蛋白有关，有待进一步研究。

［1］谭慧心.拓扑异构酶I抑制剂研究进展［J］.中国药理学通报,2009,25（4）：436-441.

［2］Liu X,Lin J,Bao Y,et al.Camptothecin-mediated apoptosis and antiproliferation effect is accompanied by down-regulation of telomerase activity in HaCaT cells［J］.J Dermatol Sci,2006,42（3）：262-264.

［3］Bertozzi D,Marinello J,Manzo SG,et al.The natural inhibitor of DNA topoisomerase I,camptothecin,modulates HIF-1α activity by changing miR expression patterns in human cancer cells［J］.Mol Cancer Ther,2014,13（1）：239-248.

［4］Rosenberger C,Solovan C,Rosenberger AD,et al.Upregulation of hypoxia-inducible factors in normal and psoriatic skin［J］.J Invest Dermatol,2007,127（10）：2445-2452.

［5］Ioannou M,Sourli F,Mylonis I,et al.Increased HIF-1 alpha immunostaining in psoriasis compared to psoriasiform dermatitides［J］.J Cutan Pathol,2009,36（12）：1255-1261.

［6］Liang WC,Wu X,Peale FV,et al.Cross-species vascular endothelial growth factor（VEGF）-blocking antibodies completely inhibit the growth of human tumor xenografts and measure the contribution of stromal VEGF［J］.J Biol Chem,2006,281（2）：951-961.

［7］Simonetti O,Lucarini G,Goteri G,et al.VEGF is likely a key factor in the link between inflammation and angiogenesis in psoriasis：results of an immunohistochemical study［J］.Int J Immunopathol Pharmacol,2006,19（4）：751-760.

［8］Nofal A,Al-Makhzangy I,Attwa E,et al.Vascular endothelial growth factor in psoriasis：an indicator of disease severity and control［J］.J Eur Acad Dermatol Venereol,2009,23（7）：803-806.

［9］杨井,陶娟,陆捷洁,等.缺氧诱导因子1α和葡萄糖转运蛋白1在银屑病皮损中的表达［J］.中华皮肤科杂志,2009,42（3）：154-156.

［10］Bosco MC,Puppo M,Santangelo C,et al.Hypoxia modifies the transcriptome of primary human monocytes：modulation of novel immune-related genes and identification of CC-chemokine ligand 20 as a new hypoxia-inducible gene［J］.J Immunol,2006,177（3）：1941-1955.

［11］中国医师协会皮肤科医师分会中西医皮肤科亚专业委员会.中成药治疗寻常性银屑病专家共识（2014）［J］.中华皮肤科杂志,2014,47（3）：215-216.

［12］Sun J,Dou W,Zhao Y,et al.A comparison of the effects of topical treatment of calcipotriol,camptothecin,clobetasol and tazarotene on an imiquimod-induced psoriasis-like mouse model［J］.Immunopharmacol Immunotoxicol,2014,36（1）：17-24.

2014-12-17）

（本文编辑：吴晓初）

Effects of camptothecin on the expression of hypoxia-inducible factor-1α in HaCaT cells

Zhang Liangyu,Wang Xiang,Lu Yaqi,Zhu Xiaoyang,Chen Yang.Department of Dermatology,98th Hospital of PLA;98 Clinical Medical College Affiliated to Anhui Medical University,Huzhou 313000,Zhejiang,China

Chen Yang,Email：98cy@163.com

ObjectiveTo estimate the effects of camptothecin （CPT）on the expression of hypoxia-inducible factor-1α （HIF-1α）in HaCaT cells under hypoxic conditions （2%O2）,and to explore the potential therapeutic mechanism of topical CPT for psoriasis.MethodsSome HaCaT cells were classified into 6 groups：5 test groups cultured in Dulbecco′s modified Eagle′s medium（DMEM）with the presence of CPT at 12.5,25,50,100 and 200 nmol/L respectively,and 1 control group cultured in DMEM with the presence of dimethyl sulfoxide（DMSO）.All the 6 groups of cells were cultured under normoxic conditions for 12,24,48 or 72 hours or under hypoxic conditions for 12 hours.Cell counting kit-8 （CCK-8）assay was conducted to estimate the proliferation of HaCaT cells after the normoxic culture,and Western blot to quantify the protein expression of HIF-1α after the hypoxic culture.Some HaCaT cells were classified into a normoxia group（21%O2）and a hypoxia group（2%O2）,and each group was divided into a CPT（100 nmol/L）-treated subgroup and a non-intervention subgroup（treated with the vehicle）.After 12-hour culture,real-time fluorescencebased quantitative PCR was performed to measure the mRNA expression of HIF-1α.Statistical analysis was carried out by using Levene′.s test,one-way analysis of variance,Dunnett-ttest and factorial analysis with the SPSS16.0 software.ResultsAfter treatment with CPT at 12.5－200 nmol/L for 12－72 hours,the proliferation of HaCaT cells was inhibited in a concentration-and time-dependent manner.More concretely,the cell proliferation rates were inhibited by 17.66%±6.46%,33.11%±4.63%and 56.31%±1.69%respectively in HaCaT cells after 12-hour treatment with 200 nmol/L CPT as well as 24-hour treatment with 100 and 200 nmol/L CPT compared with the control group at the corresponding time points（allP＜0.05）.The protein expression level of HIF-1α was significantly decreased in HaCaT cells after 12-hour treatment with CPT at 12.5,25,50,100 and 200 nmol/L under hypoxic conditions compared with the control group（0.348±0.065,0.261±0.112,0.115±0.043,0.045±0.024 vs.1.445±0.329,allP＜0.05）.The mRNA expression level of HIF-1α（expressed as△Ct）in the CPT-treated subgroup and non-intervention subgroup was－5.575 ± 0.29 and－5.451±0.21 respectively in the normoxia group,significantly higher than that in the hypoxia group（－6.543±0.57 and－6.203±0.31 respectively,F=29.856,P＜0.05）,while there was no significant difference between the CPT-treated and non-intervention subgroups（F=1.667,P＞0.05）.ConclusionsCPT at 100 nmol/L could inhibit the expression of HIF-1α protein,but had no obvious effect on that of HIF-1α mRNA.

Psoriasis;Camptothecin;Hypoxia-inducible factor 1;Cell hypoxia;HaCaT cells

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.06.010

南京军区医学科技创新项目（12Z03）；全军医学科技青年培育项目（13QNP045）

313000浙江湖州，安徽医科大学解放军九八临床学院，解放军第九八医院皮肤科

陈扬，Email：98cy@163.com