野菊花提取物对牙龈卟啉单胞菌胰酶样蛋白酶活性的抑制作用

陈春雨，刘 鹤，何 畔，卢建忠，应 頔，马 宁

（吉林大学口腔医院牙周病科，吉林 长春 130021）

野菊花是野菊的头状花序，野生资源非常丰富。以往对野菊花抑菌的临床研究较为多见，其主要用于抑制引起机体感染和疾病的病原真菌。有研究［1－2］表明：野菊花中主要含黄酮、萜类和挥发油等成分，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化以及免疫调节等作用。被称为 “广谱抗生素”的野菊花是一种理想的安全性很高的药食同源的植物。牙龈卟啉单胞菌 （Porphyromonas gingivalis，P.g）是革兰阴性无芽孢球杆菌，是牙周病、尤其是慢性牙周病病变区或活动部位最主要的优势菌，与牙周炎治疗后复发及病情加重有关。在P.g众多的毒力因子当中，胰酶样蛋白酶 （trypsin－like protease，TLP）的活性较高，是P.g最重要的毒力因子之一，通过多种途径破坏牙周组织［3］。牙周病的治疗药物应有效地抑制牙周致病菌，目前对野菊花对牙周病治疗作用机制国内外尚无相关报道。本实验通过研究野菊花提取物对P.g的最小抑菌浓度及其对P.g生长的影响，探讨野菊花提取物对牙周致病菌的抑制作用及对牙周炎的治疗作用，以期为野菊花成为治疗牙周病药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验菌株 P.g ATCC33277由本院牙周病科提供。将－80℃保存的P.g ATCC33277于常温下解冻后，接种于血琼脂平板上，在37℃厌氧条件下培养48h后传代，经染色及镜下形态学观查确定其为纯培养后，采用麦氏比浊法用磷酸盐缓冲液 （PBS，pH 7.2）配制成 P.g 细菌悬浊液（108CFU·mL－1）备用。

1.2 主要试剂和仪器 牛心脑浸液培养基 （BHI培养基，5mg·L－1），0.2mmol·L－1苯甲酸－L－精氨酸对硝基苯胺（Na－Benzoyl－L－Arginine－PNitroanizide，BAPNA， 美国Sigma 公司 ），10mmol·L－1二硫基苏糖醇（Dithiothreitol，DTT，美国Setra公司），2500U·mg－1标准胰蛋白酶 （trypsin，上海甄准生物科技有限公司），0.1%Triton X－100 （Por－analysi，德国Merck公司），50mmol· L－1Tris－HCL （PH 7.5），0.01%G－250考马斯亮蓝染色液，标准牛血清白蛋白，PBS缓冲液 （PH 7.2）。722型紫外分光光度计和厌氧培养箱 （上海龙跃公司），低温冷冻高速离心机中离心 （长沙）。

1.3 野菊花提取物配制提取物 前期实验得出野菊花提取物对P.g最小抑菌浓度为1.250g·L－1，本实验为测野菊花提取物对P.g的TLP活性的影响，所以选择低于最小抑菌浓度的浓度值，并采用对倍稀释法将野菊花提取物配制成0.6250、0.3125和0.1563g·L－1。

1.4 细菌培养和处理 取2mL EP管5个，分为5组，每组另设5个平行管：其中3个平行管作为实验组，加入野菊花提取物系列稀释液，分别为低、中和高浓度野菊花提取物组 （采用对倍稀释法，选取小于最小抑菌浓度的3个浓度梯度）；阴性对照组加入低浓度野菊花提取物，不加P.g；阳性对照组不加野菊花提取物。在上述5组EP管中分别加入BHI培养基，P.g菌悬液，PBS缓冲液。低、中和高浓度野菊花提取物组及阴性对照组加入野菊花提取物0.5mL。将上述EP管在厌氧箱中37℃培养48h。

肉眼见细菌生长，并在镜下经形态学鉴定为纯P.g培养物后，将EP管置于低温冷冻高速离心机中离心 （13000r·min－1、4℃）6min，收集上清液 （培养物上清液）备用。收集离心后剩余的菌细胞，经PBS洗涤3次，用PBS配成P.g菌悬液，进行超声破碎 （10Hz，冰浴0～4℃，破碎5s，休息10s，重复6次），直到镜下见菌细胞完全破碎为止，将上述破碎后的菌悬液置于低温冷冻高速离心机中再次离心 （13000r·min－1、4 ℃）6min，收集上清液 （菌细胞破碎后上清液）备用。

1.5 TLP活性的测定 取1块96孔板 （每孔容积350μL），选其中14孔作为标准孔，分为7组，每组2孔，其中2孔为空白孔和5孔为实验孔。实验孔按野菊花提取物浓度不同分为低、中、高浓度野菊花提取物组、阴性对照组和阳性对照组，每组2孔。分别在标准孔、空白孔、实验孔中加入140μL Tris－HCL、100μL BAPNA、10μL DTT和10μL TritonX－100后，将96孔板放入温度为37℃的THZ－C型恒温振荡器中振荡10min，使混合液充分混匀，取出96孔板，在空白孔中加入30μL Tris－HCL （标准胰蛋白酶浓度为0U·mL－1），在实验孔中分别加入30μL培养物上清液和30μL菌细胞破碎后上清液，再将反应板放入温度为37℃的THZ－C型恒温振荡器中振荡15min，使其充分反应，取出96孔板在紫外光分光光度计下测定每孔液体的吸光度 （A）值 （λ＝405nm），空白孔用于调零。用同样方法制备胰蛋白酶标准曲线，只是在标准孔中加入30μL经系列稀释的标准胰蛋白酶 （浓度0～8000U·mL－1），以标准孔中胰酶活性单位为横坐标，其A值为纵坐标，做出胰酶样蛋白酶的标准曲线，以实验孔中2种上清液的A值在标准曲线上的投射点算出其横坐标值，即TLP活性值。

1.6 上清液中蛋白浓度的测定 取1块96孔板（每孔容积350μL），选其中7孔为标准孔，2孔为空白孔，实验孔则按野菊花提取物浓度不同分成5组，其中包括阴性对照组和阳性对照组，每组为2孔。在空白孔中加入10μL PBS缓冲液 （牛血清白蛋白浓度为0g·L－1）、实验孔中分别加入10μL培养基上清液和菌细胞上清液。然后在每个反应孔中分别加入280μL考马斯亮蓝G－250染色液，室温反应2min并震荡10s，之后在紫外光分光光度计下采取比浊法测定蛋白浓度的A值 （λ＝405nm），空白孔用于调零。采用同样方法制备牛血清白蛋白标准曲线。不同的是在标准孔中则分别加入10μL牛血清白蛋白溶液 （对倍稀释7个浓度梯度，0～6.25g·L－1）。以标准孔中牛血清白蛋白浓度为横坐标，其A值为纵坐标，作出标准曲线。以实验孔中2种上清液的A值在标准曲线上的投射点，计算出其横坐标值，即蛋白浓度（g·L－1）。

1.7 TLP比活的测定 以实验孔中TLP的活性值除以其所含的蛋白浓度表示每克蛋白所含的TLP的活性单位，即比活。

1.8 统计学分析 采用SPSS 11.5统计软件对数据进行统计学分析。各组上清液中TLP活性、蛋白水平和TLP比活以表示，组间比较采用单因素方差分析。以α＝0.05为检验水准。

2 结 果

与阳性对照组比较，中、高浓度野菊花提取物组上清液中TLP活性 （游离态和结合态）均降低（P＜0.05）；与低浓度野菊花提取物组比较，中、高浓度野菊花提取物组上清液中TLP活性 （游离态和结合态）均降低 （P＜0.05）；与中浓度野菊花提取物组比较，高浓度野菊花提取物组上清液中TLP活性 （游离态和结合态）均降低 （P＜0.05）。各组上清液中蛋白水平和TLP比活无明显变化（P＞0.05）。见表1。

表1 各组上清液中TLP活性、蛋白和TLP比活Tab.1 Activities of TLP，levels of proteins and TLP specific activities in supernatant fluid in various groups （）

表1 各组上清液中TLP活性、蛋白和TLP比活Tab.1 Activities of TLP，levels of proteins and TLP specific activities in supernatant fluid in various groups （）

＊ P＜0.05 vs positive control group；△ P＜0.05 vs low concentration of wild chrysanthemum extract group；#P＜0.05 vs medium concentration of wild chrysanthemum extract group.“－”：No data.

Group TLP activity［λB／（U·mL－1Protein［ρB／（g·L－1 ernatant Negative control － － － －Positive control 5332.39±47.27 7562.38±35.37 0.35±0.25 0.3500±0.21 Wild chrysanthemum extract Low 4879.73±38.34 6254.67±69.74 0.32±0.15 0.3096±0.10 Medium 2764.54±25.79＊△ 3887.49±46.20＊△ 0.21±0.20 0.2247±0.20 High 1487.81±34.63＊△#2638.25±73.21＊△# 0.14±0.21 0.1950±0.15 Group TLP specific activity［λB／（U·mg－1 ernatant Negative control －）］Culture supernatant Fragmentation sup－Positive control 15478.45±536.35 21646.73±386.34 Wild chrysanthemum extract Low 15296.57±565.60 20245.42±734.59 Medium 12984.76±428.97 17328.93±530.96 High 10788.50±364.90 13592.89±685.04）］Culture supernatant Fragmentation supernatant）］Culture supernatant Fragmentation sup

3 讨 论

目前，牙周病主要治疗手段是牙周基础治疗辅以抗生素，但抗生素副作用较大，会使细菌产生耐药性，影响治疗效果。因此，国内外学者均致力于研究一种新的药物来抑制牙周致病菌。而中药应用方便、吸收快捷、药效明显、不易产生耐药性，使其成为近年来的研究热点。张红梅等［4］采用液体二倍稀释法研究发现：五倍子水提物能够抑制P.g的生长及其毒力作用。左渝陵等［5］利用荧光分光光度计检测荧光底物的降解发现：骨碎补水提物能有效抑制P.g的TLP活性，其抑制作用能降低细菌的生长，减缓牙菌斑的形成。毛胜凤等［6］采用菊米（野菊花的花蕾或花蕊）和成熟期的野菊花，通过琼脂平板培养法观察细菌的生长情况并进行比较发现：菊米和成熟期的野菊花对枯草杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果均较其对青霉等霉菌及啤酒酵母的抑菌效果明显，其中对大肠杆菌的敏感度最高。但菊米较成熟期野菊花的抑菌效果更明显。胡浩斌等［7］采用野菊花挥发油通过体外实验证明：野菊花对金黄色葡萄球菌、白喉杆菌、大肠杆菌、结核杆菌和白色念球菌有一定程度的抑制作用，尤其是挥发油醇稀释液致使白色念球菌在体外不生长，并且挥发油的醇稀释液的抑菌效果优于醚的稀释液。溶解于不同稀释液所产生的不同抑菌效果为野菊花中有效成分的提取及相关药物的研发提供了理论依据。

野菊花具有抑菌活性已是公认的事实。而且野菊花在我国各地分布广泛，被称为中草药中的 “广谱抗生素”，更具有临床意义。但应用野菊花作用于P.g的研究尚未见报道。在我国丰富的中药资源中，野菊花分布广泛，原料易得，已广泛应用于食品安全和医疗保健等领域。魏艳等［8］采用柱层析和薄层层析技术从野菊花中提取到的刺槐素7－芸香糖苷，对其进行杀菌活性测定，证明其可以抑制苹果腐烂病菌的生长；野菊花的医药保健价值较高，在心血管疾病治疗中有血管舒张作用［9］；此外，野菊花提取物能够通过抑制人肝癌细胞有丝分裂对肝肿瘤细胞的生长起抑制作用［10］，且可以将其用于治疗感染性疾病［11］和病毒性疾病［12］。野菊花药效温和持久，对组织刺激性小，安全无毒副作用，细菌不易产生耐药性，不会引起长期使用抗生素产生的菌群失调，用其治疗牙周炎将拓展牙周用药范围并实现其药用价值。P.g是公认的牙周致病菌之一，在牙周病的发生发展过程中起重要的作用［13－14］。P.g可以产生多种毒力因子，其中 TPL是其分泌的主要毒力因子之一，是导致慢性牙周病的主要因素之一［15］。TLP还能降低抗体的调理作用，抑制免疫反应，导致牙周炎炎症过程中龈沟液的渗出，降低牙周组织局部的免疫功能［16］。

本实验测定了菌细胞破碎后上清液中TLP活性即与菌细胞结合的结合态TLP活性及培养物上清液中的TLP活性 （细菌分泌到培养物中呈游离态的TLP活性）。本研究结果显示：在未加野菊花提取物时，P.g培养物上清液中结合状态的TLP活性比游离态高，说明TLP主要结合于P.g细胞膜表面；结合态的TLP比活高于游离态，说明结合态TLP水解蛋白的能力强于游离态。本研究结果显示：中、高浓度野菊花提取物组和阳性对照组之间TLP活性比较差异有统计学意义，说明当野菊花提取物浓度为0.6250和0.1325g·L－1时，2种状态的TLP活性均降低，野菊花提取物对TLP活性及蛋白水解作用有明显的抑制作用；当野菊花提取物浓度为0.1563g·L－1时，对游离状态与结合态的TLP比活无明显影响。当野菊花提取物浓度降低时，结合态和游离态TLP活性升高，野菊花提取物浓度越高，对P.g的TLP酶抑制作用越强。

同时，培养物上清液中TLP活性低于菌细胞破碎后上清液，且酶比活也较低，在同一野菊花提取物浓度下，3个野菊花组上清液中游离态TLP比活与结合态TLP比活比较差异有统计学意义，说明野菊花提取物对游离态的TLP的抑制作用强于结合态TLP。

本研究结果表明：对倍稀释法稀释野菊花提物取对P.g结合态TLP活性和蛋白水解能力有明显抑制作用，浓度越大，抑制作用越强；高浓度野菊花提取物对游离态TLP活性及蛋白水解能力有抑制作用，而低浓度野菊花提取物对游离态TLP活性及蛋白水解能力的抑制作用不明显。

中药野菊花在我国分布广泛，原料易得，安全无毒副作用，不会引起长期使用抗生素产生的耐药性和菌群失调，在口腔牙周病防治方面具有广阔的应用前景。

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