严重烧伤对大鼠海马神经细胞自噬和神经胶质细胞反应的诱导作用

李 雷，王永杰，陈 浩，秦永刚，周煜博，赵嘉勋，郭 丽

（吉林大学公共卫生学院卫生毒理学教研室，吉林 长春 130021）

烧伤是热、电、化学和放射等造成损伤的总称，是医学界一直关注的研究重点。严重烧伤并发多器官功能障碍综合征的死亡率极高。严重烧伤引起机体低灌注造成全身性的缺血缺氧和代谢障碍、炎症反应和Ca2＋稳态失调等是造成多器官衰竭的重要机制［1－2］。海马体是人类大脑的重要功能区，与学习记忆等高级功能有密切关联，对炎症和缺血低灌注损伤极具易感性，是介导应激反应的主要中枢结构，也是应激作用的主要靶器官［3］。研究［4］表明：血脑屏障早在严重烧伤7h后开放，并持续数天。严重烧伤后，炎症反应进一步对大脑造成损害［5］。Li等［6］证实：烧伤后大脑血管内皮、神经元和突触有不同程度的坏死。自噬是真核细胞的细胞器和蛋白质分子降解的主要细胞路径［7］，机体受到应激刺激可过度激活自噬的发生，造成细胞死亡和组织功能受损。Zhu等［8］研究发现：利用小鼠构建缺血缺氧模型，在脑缺血8h后大量自噬泡形成，自噬相关蛋白轻链3蛋白 （light chain 3 protein，LC3B）高表达。并且在神经退行性病变中过度自噬可引起神经细胞坏死［9］。自噬标志物轻链3（light chain 3，LC3）的活性形式LC3B是自噬体膜的特异性组成成分，可指示自噬激活。Beclin 1也是常用做评价自噬激活的指示蛋白［10］。

神经胶质细胞是中枢神经系统的主要细胞类型，具有滋养神经细胞、传递信息的作用，在中枢神经系统受到损伤时，能保护和重塑神经元［11］。研究［12］表明：在正常情况下神经胶质细胞标志物神经胶质纤维酸性蛋白 （glial fibrillary acidic protein，GFAP）受星形胶质细胞的动力调节，损伤后增生的GFAP阳性星形胶质细胞能促进星形胶质细胞的有丝分裂，使原始祖细胞分化为成熟的星形胶质细胞，GFAP是神经胶质细胞反应性增生的标志。在中枢神经受到刺激或损伤，神经胶质细胞会反应性增生，代偿保护神经元免受应激等带来的损伤［13］。

目前，关于严重烧伤后海马损伤研究主要集中在神经标志物方面，对烧伤能否引起神经细胞自噬和神经胶质细胞反应未见报道。因此，本实验通过制备严重烧伤大鼠模型，探讨大鼠海马体神经细胞在烧伤刺激后的改变，阐明自噬和神经胶质细胞反应在海马体神经细胞损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年雄性Wistar大鼠20只，体质量 （200±20）g，购于吉林大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK－（吉）2008－0005。随机分为正常对照组和模型组，每组10只。模型组大鼠用于制备烧伤模型。

1.2 烧伤模型的制备 根据文献 ［14］报道的方法并略有改进制备严重烧伤大鼠模型。按照Mech－Rubner公式：A （cm2）＝ K·W2／3［A，动物体表面积；K＝9.1（大鼠）；W，动物体质量］，计算动物30%总体表面积 （total body surface area，TBSA），并在大鼠背部进行标记。大鼠烧伤前背部剃毛，8%硫化钠脱毛，清水洗净晾干，备皮待处理。以0.3mL·100g－1体质量的剂量向腹腔内注射10%水合氯醛溶液麻醉后，将大鼠背部的标记区域浸入 （97±1）℃水中18s，造成30%TBSAⅢ度烫伤，之后立即按4mL·100g－1剂量腹腔注入生理盐水抗休克，分笼饲养，自由进食、饮水。

1.3 大鼠一般情况观察 造模后1周内观察大鼠进食、饮水等情况。

1.4 大鼠海马体神经细胞病理组织学观察 造模1周后断头取大鼠大脑，固定于10%甲醛固定液中。石蜡包埋，切片，HE染色和尼氏体染色，显微镜下观察大鼠海马体的病理组织学表现。

1.5 免疫组织化学法检测大鼠海马体GFAP、神经元标志物微管相关蛋白2（MAP－2）和LC3B、Beclin 1的表达 采用SP法：石蜡切片常规脱蜡，自来水洗3次；98℃枸橼酸溶液抗原修复5min；室温冷却；内源性过氧化物酶阻断剂室温孵育30min；PBS洗3次；动物非免疫血清，室温封闭30min；加一抗 （GFAP和MAP－2，1∶300稀释；LC3B和Beclin 1，1∶200稀释），4℃过夜；PBS洗3次；生物素标记二抗，室温孵育30min；PBS洗3次；加入链霉素抗生物素蛋白－过氧化物酶，室温孵育30min；PBS洗3次；DAB显色；自来水洗2次；苏木精复染；弱氨水返蓝；过梯度酒精和二甲苯，脱水透明；中性树脂封片。采用Image Pro Plus 6.0软件分析 GFAP、MAP－2、LC3B和Beclin 1的表达情况，以积分光密度 （IA）值表示蛋白表达量。

1.6 统计学分析 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。各组大鼠海马体神经胶质细胞中GFAP、MAP－2、LC3B和Beclin 1蛋白表达水平以表示，组间均数比较采用t检验。以α＝0.05为检验水准。

2 结 果

2.1 大鼠的一般情况 正常对照组大鼠进食、饮水正常，活泼、好动；模型组大鼠在烧伤后1周内进食、饮水减少，萎靡少动。

2.2 大鼠海马体组织病理形态学 大鼠烧伤后1周，HE染色结果：模型组大鼠海马体神经细胞呈水肿状态，核固缩；尼氏体染色结果：模型组大鼠神经细胞内尼氏体淡染，排列紊乱。正常对照组大鼠神经细胞中未观察到组织病理改变。见图1。

2.3 免疫组织化学法检测大鼠海马体神经细胞标志物的表达 模型组大鼠海马体神经胶质细胞中GFAP呈高表达，MAP－2表达较少。模型组大鼠海马体神经胶质细胞中GFAP表达明显高于正常对照组 （P＜0.05）；模型组大鼠海马体神经胶质细胞中MAP－2的表达明显低于正常对照组 （P＜0.05）。见图2和表1。

2.4 免疫组织化学法检测大鼠海马体神经胶质细胞中LC3B和Beclin 1的表达 模型组大鼠海马体神经胶质细胞中LC3B和Beclin 1自噬蛋白均呈高表达。模型组大鼠海马体神经胶质细胞中LC3B和Beclin 1表达水平明显高于正常对照组 （P＜0.05）。见图3和表1。

表1 严重烧伤大鼠海马体神经胶质细胞中GFAP、MAP－2、LC3B和Beclin 1的表达水平Tab.1 Expression levels of GFAP，MAP－2，LC3B，and Beclin 1in neuroglia cells in hippocampus tissue of severe burn rats（）

表1 严重烧伤大鼠海马体神经胶质细胞中GFAP、MAP－2、LC3B和Beclin 1的表达水平Tab.1 Expression levels of GFAP，MAP－2，LC3B，and Beclin 1in neuroglia cells in hippocampus tissue of severe burn rats（）

＊ P＜0.05compared with normal control group.

Group IA GFAP MAP－2 LC3B Beclin 1 Normal control 3756.38±383.09 10405.05±1472.38 686.52±85.56 982.95±65.68 Model 14372.61±1500.86＊ 4417.90±802.66＊ 2710.84±175.98＊ 4951.59±1062.94＊

3 讨 论

本研究结果显示：模型组大鼠烧伤后1周，状态较差；HE和尼氏体染色病理观察显示：模型组大鼠的海马神经细胞受损；神经元标志物MAP－2在模型组大鼠海马体低表达进一步说明受损的神经细胞包括神经元。神经胶质细胞标志物GFAP在海马体高表达提示：烧伤后海马体的神经胶质细胞活化，出现反应性增生的现象。同时，模型组大鼠海马体神经细胞中LC3B和Beclin 1表达明显升高提示：烧伤后海马体的神经细胞出现过度自噬。

有研究［15］表明：缺血、缺氧和炎性介质等可造成海马部位神经元损伤。严重烧伤易造成脏器缺血缺氧、细胞中钙超载、能量代谢障碍、机体炎症反应和释放氧自由基及炎症因子等。在血脑屏障开放的情况下，氧自由基和炎症因子等进入中枢神经系统，可造成海马体神经细胞损伤［4］。自噬标志性蛋白LC3B和Beclin 1在模型组大鼠海马体中呈高表达，表明烧伤启动了神经细胞的过度自噬过程可能是神经细胞损伤的机制。研究［16－17］表明：创伤性脑损伤 （TBI）中，谷氨酸转运体GLT－1活性明显下降，细胞外谷氨酸浓度升高，从而产生神经毒性，可能导致神经元自噬的发生。GLT－1活性下调可导致细胞外谷氨酸浓度升高，刺激NMDA受体、代谢型谷氨酸受体1（mGluRl）和红藻氨酸盐受体，导致了神经元自噬发生及兴奋性神经元死亡［18］。由此推测严重烧伤可能降低了大鼠海马GLT－1转运体活性，引起海马过度自噬的激活。

另外，GFAP作为神经胶质细胞的标志物，在模型组大鼠的海马体中呈高表达，可能是神经胶质细胞对神经元的代偿性保护。研究［13，19－21］显示：脑缺血后星形胶质细胞反应性上调缝隙连接蛋白Cx43和Cx43mRNA的表达，保护受损的神经细胞。

综上所述，烧伤作为损伤因素在损伤模型中起主要作用，最终引起神经细胞死亡。严重烧伤可诱发中枢神经系统海马体的神经细胞的过度自噬，损伤神经细胞，受损神经细胞可启动神经胶质细胞反应性增生以减轻损伤强度，但具体机制及两者关系仍需深入研究。

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