栝楼薤白半夏汤对MIRI大鼠VEGF蛋白、基因表达及MVD影响的实验研究

杨 丽，张炳填*，湛锦源，肖秀琦，何 栋

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙410208；2.湖南长沙医学院，湖南 长沙410007）

心肌缺血再灌注损伤 （myocardial ischermic reperfusion injure，MIRI） 的发病机制及防治是当今备受关注的热门课题，其中血管病变是缺血心肌病的根本原因。 栝楼薤白半夏汤 （Gualou Xiebai Banxia Decoction，GXBD） 出自张仲景的 《金匮要略》，是治疗胸痹的名方，此方现在多用于心血管疾病的治疗。 本课题前期实验结果显示GXBD 能保护内皮细胞、改善心肌细胞凋亡和对心肌细胞信号传导通路的介导以保护缺血再灌注损伤心肌[1-3]。 本文通过观察GXBD 对血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 蛋白与基因的表达、微血管密度（microvessel density，MVD）的影响，探讨此方防治MIRI 的新机制。

1 材料

1.1 动物

3月龄雄性SD 大鼠50 只，体质量220～250 g。由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号SCXK（湘）2013-0004，饲养于湖南中医药大学动物实验室，室内清洁，自然采光，通风良好。

1.2 药物与试剂

栝楼薤白半夏汤[4]（栝楼30 g， 薤白15 g， 半夏10 g，白酒30 mL）。白酒购自市售的米酒头（酒精含量35%）。 7 剂药材按照文献[5]浓缩至含生药1 g/mL，共385 mL，4 ℃条件下保存备用。SYBR Green PCR 试剂盒、逆转录试剂盒：Thermo 公司产品；一抗Rabbitanti-VEGF（批号：12320）；Rabbit-anti-CD34；二抗通用型PV-9000Kit 试剂盒，均为武汉搏士德生物公司产品。

1.3 仪器

RWD407 型小动物人工呼吸机（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），MP150 型16 导生理记录仪（美国BIOPAC 公司），EICADMLB2 型光学显微镜（中国上海第三分析仪器厂制造），JY5002 型电子天平 （上海雷韵试验仪器制造有限公司）；PCR 仪器（德国Eppendorf 公司）；DYY-6C 电泳仪（北京六一仪器厂）。

2 方法

2.1 分组与给药

将SD 雄性大鼠50 只，随机分为5 组，每组10只（死亡后即剔除）。 分组情况如下： 假手术组（A组），模型组（B 组），缺血预处理组（C 组），栝楼薤白半夏汤低剂量预处理组（D 组），栝楼薤白半夏汤高剂量预处理组（E 组）。 A、B、C 组每天灌胃等量生理盐水，D、E 组每天灌胃栝楼薤白半夏汤水煎液，剂量分别是4.6 g/kg、18.4 g/kg（药物剂量按人鼠体表面积计算出大鼠的等效剂量），连续7 d。 末次灌胃1 h 后，各组分别行以下处理：A 组：在冠状动脉左前降支只穿线不结扎；B、D、E 组：结扎30 min，再灌注90 min；C 组：缺血5 min，再灌注15 min，反复3次，立即重复B 组实验方法。

2.2 动物造模

参照文献[6]造心肌缺血再灌注损伤模型，以心电图出现ST 段弓背样抬高为结扎成功， 松开活结抽出垫线与穿线，恢复血流再灌，以抬高的ST 段缓慢下降1/2 为再灌注成功。

2.3 指标检测

2.3.1 VEGF 蛋白表达 术后取心肌组织，标本经4℅多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，用SABC 法切片脱蜡，灭活内源性酶，热修复抗原，滴加BSA 封闭液，后滴加稀释的一抗（1∶100），PBS 洗后，滴加二抗，再用PBS 洗，后滴加DAB 显色，水洗终止显色，苏木素复染，封片。 结果阳性表达的部位显黄色或棕黄色，细胞核紫蓝色，其他部位无色。 用Motic 显微摄像仪及图像分析软件测量免疫组化染色的平均光密度值。

2.3.2 VEGF 基因（VEGF mRNA）表达 术后取心肌组织，标本置于-80 ℃冰箱固定后，取组织于Trizol 的匀浆管中匀浆20 s 后于超净台中温育5 min，12 000 r/min，离心10 min；吸上清液，加入氯仿，摇匀，室温静置2 min，于4 ℃、12 000 r/min 中离心10 min； 吸上清液加入异丙醇， 摇匀， 室温静置15 min，4 ℃，12 000 r/min，离心15 min，弃上清；加入1 mL 75%的无水乙醇， 漂洗沉淀，4 ℃，12 000 r/min，离心5 min，弃上清；重复前1 次步骤后，室温干燥10 min；加入40 μL 的DEPC 水溶解RNA，20 L 体系逆转录合成cDNA。 VEGF 特异引物，长度为20 bp，预期产物大小为187 bps。上游引物：5'-CCAAAGCCAGCACATAGG-3'， 下 游 引 物：5'-TCTCCGCTCTGAACAAGG-3'；GAPDH 引 物，长度为20 bp， 预期产物大小为191 bps。 上游引物：5'-ATCACTGCCACCCAGAAG-3'， 下 游 引 物：5'-TCCACGACGGACACATTG-3'。 引物由上海捷瑞合成，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参，按照反转录试剂盒PCR （reverse transcription PCR，RT-PCR）试剂盒说明，在PCR 仪上进行PCR 扩增。扩增产物进行电泳。 摄片测其平均光密度值，计算VEGF mRNA 的相对表达量。

2.3.3 MVD 测定 选取左心室缺血区心肌组织，灌注固定，制作切片，行特异性免疫组化染色。40 倍光镜下扫视整个切片，选择5个梗死区周围血管密度最高的区域。 在400 倍光镜视野下计数毛细血管（MVC），单个的内皮细胞、内皮细胞簇、微小血管均予计数，管腔大于8个红细胞大小、带有肌层的血管均不予计数。 以MVC/mm2表示MVD。

2.4 统计学分析

采用SPSS 17.0 统计软件，计量资料若符合正态分布，以“±s”表示，组间比较用单因素的方差分析，方差齐时每两组之间的比较用LSD 法， 方差不齐时采用Tamhane’s T2。 P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

各组MIRI 大鼠VEGF 蛋白、 基因表达与MVD的比较

与A 组比较，B、C、D、E 组VEGF 蛋白、 基因表达水平均升高 （P＜0.05 或P＜0.01），MVD 显著升高（P＜0.01）； 与B 组比较，C、D、E 组VEGF 蛋白表达均有升高（P＜0.05 或P＜0.01），VEGF 基因、MVD 显著升高（P＜0.01）；与C 组比较，D 组VEGF 蛋白、基因与MVD 明显升高（P＜0.01），C、E 两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表1。 VEGF 蛋白表达见封三彩图图1。

表1 各组大鼠VEGF 蛋白、VEGF mRNA 表达、MVD 的比较 （±s，n=6）

表1 各组大鼠VEGF 蛋白、VEGF mRNA 表达、MVD 的比较 （±s，n=6）

注： 与A 组比较△P＜0.05，△△P＜0.01； 与B 组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与C 组比较▲▲P＜0.01。

组别A 组B 组C 组D 组E 组VEGF 蛋白0.216±0.045 0.284±0.026△0.374±0.088△△*0.486±0.046△△**▲▲0.400±0.026△△**VEGF mRNA 0.237±0.078 0.315±0.052△0.531±0.038△△**0.825±0.059△△**▲▲0.571±0.037△△**MVD（mm2）3.60±1.140 7.80±0.837△△13.00±1.225△△**17.20±0.837△△**▲▲14.20±0.837△△**

4 讨论

心肌缺血后，由于缺血、缺氧导致心肌细胞水肿、充血、坏死、凋亡，心肌功能受损。 因此及时有效地恢复缺血心肌的血流灌注，对缺血心肌功能的恢复至关重要。 然而现代的再灌注手段溶栓、冠脉搭桥等虽在一定程度上能减轻心肌缺血，但也能引起血管内皮功能受损、代谢功能障碍、心肌细胞顿抑等损害， 即MIRI。 现代研究证实缺血性预处理(Ischemic Preconditioning，IPC) 对MIRI 有保护作用[7]。若能给予一些外源性的药物预处理， 起到类似IPC的作用，那么再灌注的效果会更好，且副作用小。 故本实验特设缺血预处理组（C 组）作为阳性对照组。

血管新生是指在原有血管基础上通过内皮细胞增殖和分化以芽生或非芽生的形式生成新的血管。 有研究表明促血管新生后， 缺血区的MVD 增加，梗死面积减小，心肌细胞坏死和凋亡的程度降低，心功能得以改善，因而促缺血心肌血管新生已成为治疗缺血性心脏病最具前景的方法之一[8]。 血管生成需要多种因子参与，其中VEGF 是主要的诱导因子，VEGF 的表达上调，就能促进缺血心肌组织中新血管的生成[9]。 目前研究发现缺氧、缺血状态下可以诱导VEGF 的表达，本实验也证实了这一点，B组心肌组织中VEGF 表达较A 组增加（P＜0.05）。 但这种内生性的促血管生成物质常常不足以尽快建立足够丰富的侧支血管来代偿原有血供，缺血表现得不到纠正， 如果能进行适当的途径给予外源性VEGF 或促进其产生的药物， 则可促使形成丰富的冠脉侧支循环，满足缺血心肌血供需求，纠正缺血状态。 而在研究血管新生的指标中，MVD 是反映血管新生强度的重要指标[10]。故很多实验用MVD 来检测血管新生的水平。 MVD 水平升高，表示血管新生活跃。

MIRI，根据其临床表现，一般将其归属于中医学“胸痹”、“心痛”、“真心痛”的范畴，中医药在此病的治疗上积累了丰富的经验，张仲景之《金匮要略》对其治疗有详细记载，其中GXBD 是治疗此病的主方。据现代药理实验研究，GXBD 中的各药都有保护MIRI 的作用[11-13]。 本实验结果显示：和B 组相比，C、D、E 组大鼠心肌组织中VEGF 蛋白及基因表达、MVD 均明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）， 说明通过缺血预处理、GXBD 预处理更能促进VEGF 的蛋白与基因表达，形成了更丰富的新生血管，改善缺血，对心肌组织进行保护。 与C 组比较，D 组大鼠心肌组织中VEGF 的蛋白与基因表达、MVD 明显增加， 差异有统计学意义 （P＜0.01），C、E两组差异无统计学意义（P＞0.05），说明GXBD 同缺血预处理一样达到了保护MIRI 的作用， 且低剂量组优于高剂量组。

综上所述， 在MIRI 中，GXBD 通过上调VEGF的表达，促进血管新生，最终达到预防和治疗MIRI的作用。

致谢：湖南中医药大学中医诊断研究所对本研究鼎力支持。

[1]张炳填，李鑫辉.栝蒌薤白半夏汤对急性心肌缺血大鼠血管内皮细胞保护作用的实验研究[J].新中医，2007，39（3）：104-106.

[2]晋红宾，段雪涛，张炳填，等.栝楼薤白半夏汤对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡及Bcl-2、Bax 蛋白表达影响[J].湖南中医药大学学报，2012，32（1）：13-15.

[3]段雪涛，晋红宾，易亚乔，等.栝楼薤白半夏汤预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤JAK-STAT 细胞信号传导调节的研究[J].中国实验方剂学杂志，2011，11（24）：147-150.

[4]李鑫辉，张炳填，喻 嵘.栝楼薤白半夏汤对大鼠心肌缺血保护作用实验研究[J].湖南中医药大学学报，2009，29（1）：19-21.

[5]段雪涛，晋红宾，易亚乔，等.栝楼薤白半夏汤预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤JAK-STAT 细胞信号传导调节的研究[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（24）：147-150.

[6]陈 奇.中药药理实验方法学[M].北京：人民卫生出版社，1993：536-538.

[7]Cagli K，Bagci C，Gulec M，et a1. In vivo effects of caffeic acid phenethyl ester on myocardial ischemia-reperfusion injury and apoptotic changes in rats [J]. Ann Clin Lab Sci，2005，35(4)：440-448.

[8]陈裴裴，周 昕，谢瑞芳，等.基于心肌缺血的中药促血管新生机制研究进展[J].中国中医药信息杂志，2014，21(5)：133-136.

[9]尹慧秋，张继东，林海青，等.舒脉胶囊对大鼠缺血心肌促血管新生的影响[J].中国中西医结合杂志，2007，27(11)：1 020-1 022.

[10]张秋雁，王权礼，李 雅，等.超微血府逐瘀汤对急性心肌缺血大鼠血管新生及VEGF 蛋白表达的影响[J].中医药导报，2011，17（5）：82-84.

[11]谭 斌，刘 韵，谷 彬，等.瓜蒌皮提取物对大鼠血管内皮损伤的保护作用[J].中国现代医药杂志，2010，12（9）：9-11.

[12]夏新奎，杨海霞，陈利军.薤白中脂肪酸组成的GC-MS 法分析[J].食品科技，2010，12(07)：112-113.

[13]沈雅琴，张明发.半夏的镇痛、抗溃疡和抗血栓形成作用[J].中国生化药物杂志，1998，19（3）：141.