电针对颈椎病模型大鼠椎间盘细胞Wnt1、GSK-3β蛋白的影响

黄萍萍，廖 军*，郑春水，郑佳璇，张 乐，谢巧瑜

（福建中医药大学针灸学院，福建 福州350122）

颈椎病是临床常见多发病，属中医学“痹症”、“项强”、“颈间痛”、“眩晕”等范畴[1-2]。 近年来，大量的研究显示了椎间盘细胞的衰老和凋亡是其组织退变过程中的一个非常重要的因素， 然而退变的椎间盘组织中细胞凋亡的确切病因及病理生理机制目前仍不十分清楚[3]。 最近的研究揭示，Wnt/β-catenin 信号转导通路在椎间盘退变以及维持椎间盘细胞外基质内稳定中起着重要的作用，参与着细胞生长、增殖、分化、凋亡等广泛的生物学过程[4]，成为颈椎间盘退化治疗的靶点之一。 Wnt1 是Wnt信号通路中关键的成员之一，作为Wnt 信号通路的始动因子而发挥作用；糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）则作为Wnt 信号通路的抑制因子发挥作用。 本文通过观察电针对颈椎病模型大鼠椎间盘细胞经典的Wnt 信号转导通路中关键调节因子Wnt1、GSK-3β 表达的影响，探讨电针“大椎穴”对颈椎间盘退变调控的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物来源及分组

SPF 级SD 大鼠40 只，体质量（180±20）g，雌雄各半， 由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，清洁级， 合格证编号：2007000507918， 许可证号：SCXK(沪)2007-0005。 通过随机分为空白组10 只，造模组30 只， 造模成功后随机分为模型组、 电针组、美洛昔康组，每组各10 只。 由我校实验动物中心饲养，许可证号：SYXK(闽)2005-0004。

1.2 主要药物、试剂及仪器

美洛昔康片 （上海勃林格殷格翰药业有限公司， 批号：H20020217）；HANS-100 型韩氏电针仪（石家庄福赛医疗器械有限公司）； 超低温冰箱（SANYO 公司）；水平摇床（上海琪特公司）；Trans-Blot 转印槽（Bio-Rad 公司）； 电泳仪（Bio-Rad 公司）； 垂直电泳槽 （Bio-Rad 公司）； 凝胶成像系统（Bio-Rad 公司）；DYY-6B 型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂）； 一抗 （Wnt1，Gsk-3β， 美国CST 公司）；二抗（山羊抗兔IgG，Beyotim TECHCO，Ltd）。

1.3 方法

1.3.1 动物造模 参考王拥军等[5]的方法建立动静力失衡性颈椎间盘退变大鼠模型，将大鼠仰卧固定手术台上，2%戊巴比妥钠 （40 mg/kg） 腹腔注射麻醉，麻醉起效后，予颈背备皮，碘伏消毒，取大鼠颈背部正中纵向切口， 切开皮肤及皮下组织， 长约2 cm，切开深筋膜暴露颈部的肌肉层，先切断浅肌群，再横向切断深群颈夹肌和头、颈和寰最长肌，完全切除颈髂肋肌与头半棘肌， 最后切除了C2～C7的棘上和棘间韧带，逐层缝合。 手术结束后，动物放置于室温(24 ℃)的环境下苏醒，正常饲养3个月。 空白组仅切开皮肤和皮下组织后就直接皮肤缝合， 同等条件饲养。 本实验通过电镜检测对比造模前后大鼠软骨细胞结构的变化来判断造模是否成功， 前期研究结果显示造模后的大鼠软骨细胞出现了部分凋亡或变性，与空白组相比细胞表面的微绒毛样凸起变少，细胞外基质中的胶原纤维也发生了减少， 且排列无序，细胞核内出现了明显的凋亡性改变，可见染色质固缩[6]。前期研究还提示在TUNEL 染色中，模型大鼠椎间盘纤维环细胞的细胞凋亡明显高于空白组[7-8]。

1.3.2 实验干预 （1）电针组：造模3个月后，用自制的固定夹将大鼠固定后，定位取穴参照《中国兽医针灸学》、《实验针灸学》 并结合动物比较学方法进行定位，选取大鼠“大椎穴”（第7 颈椎与第1 胸椎之间背部正中）[9]，消毒施术部位，用华佗牌的针灸针进行针刺（Φ15×0.3 mm）， 针刺深度5 mm 左右，选用韩氏电针仪，将电流输入的负极接在大椎穴，在大鼠右耳后针刺与正极连接，刺激参数选用了疏密波、频率2/100 HZ、电压2-5 V、电流1 mA，以针柄轻微的抖动为度，在适当时候可以增加刺激强度，通电25 min，1 次/d，1个疗程为14 d，疗程间休息2 d，共治疗2个疗程。 （2）美洛昔康组：造模3个月后即给予美洛昔康片灌胃治疗，1 次/d，灌胃剂量按“动物体表面积比率换算等剂量法”[7]，折算成人的等量剂量约为0.787 8 mg/kg，治疗疗程同电针组。 （3）空白组、模型组：均只作固定而不做其他任何处理，时间及疗程与电针组同。

1.4 标本采集

干预结束后次日， 给大鼠腹腔注射致死量的10% 水合氯醛致死，在4 倍手术显微镜下快速的沿上、 下软骨终板与椎体的交界面切下C2-C7的椎间盘，分离出纤维环，将其装入无菌冻存管后迅速放入液氮罐内，然后置于-80 ℃的冰箱冻存备用。

1.5 指标检测

免疫印迹法（Western blot）检测颈椎间盘纤维环细胞Wnt1、GSK-3β 蛋白表达水平： 将-80 ℃颈椎间盘组织取出， 加入液氮快速研磨后予RIPA 蛋白裂解液提取组织中的蛋白，12 000 r/min， 离心20 min（4 ℃），弃沉淀，BCA 法测定上清中蛋白浓度；配制SDS-PAGE 胶；80 V 的恒压电泳至浓缩胶与分离胶交界处， 调电压到100 V， 恒压80 V 转膜50 min，缓冲液TBST 洗（2 min×1 次），5%的脱脂牛奶封闭PVDF 膜30 min；加入一抗，稀释比例1∶2 000，4 ℃冰箱内摇床反应过夜， 一抗结束后在室温下用TBST 摇床上水洗脱色 （10 min×3 次），TBS 洗（10 min×1 次）；洗膜后按照1∶2 000 的比例用稀释辣根过氧化物酶标记的二抗的封闭液中室温孵育2 h， 室温下TBST 摇床上水洗脱色（10 min×3 次），再用TBS 洗（10 min×1 次）；洗膜后采用ECL 化学发光法、显影、定影后，凝胶成像及分析系统分析目标带的分子量和净光密度值。 Wnt1、GSK-3β 蛋白相对含量用GAPDH 作为内参。

1.6 统计学分析

数据统计采用SPSS 18.0 软件统计系统进行处理，各组所有数据均以“±s”表示。先行正态检验，符合正态检验的采用单因素方差进行分析，不符合正态检验的采用了多组样本秩和检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

分析结果表明， 模型组大鼠椎间盘中Wnt1、GSK-3β 蛋白表达与空白组比较相对减少， 差异有统计学意义(P＜0.05)；与模型组相比，电针组与美洛昔康组中Wnt1、GSK-3β 蛋白表达显著升高， 差异有统计学意义(P＜0.05)，结果见表1、图1。

表1 各组大鼠颈椎间盘纤维环细胞Wnt1、GSK-3β蛋白表达结果 （n=10，±s）

表1 各组大鼠颈椎间盘纤维环细胞Wnt1、GSK-3β蛋白表达结果 （n=10，±s）

注：与空白组比较*P＜0.05；与模型组比较△P＜0.05。

组 别空白组模型组电针组美洛昔康组Wnt1 蛋白1.070±0.130 0.879±0.104*1.024±0.142△1.040±0.128△GSK-3β 蛋白0.733±0.120 0.557±0.113*0.690±0.097△0.687±0.123△

3 讨论

椎间盘退变 (intervertebral disc degeneration，IVDD)是随着年龄增长且与多种因素有关，使得椎间盘在组织、 功能和代谢上发生改变， 导致椎间盘变硬以及强度下降。 研究显示IVDD 与椎间盘组织细胞凋亡有关， 椎间盘细胞凋亡以及因凋亡而导致的基质代谢失调， 是使椎间盘发生退变的重要因素[10]。 因此，延缓或抑制细胞凋亡是防止颈IVDD 的有效途径之一。

最近的研究揭示了Wnt/β-catenin 信号通路是一个复杂的蛋白质作用通路，不仅在调节椎间盘合成代谢因子和分解代谢因子的平衡中发挥了重要作用，而且对椎间盘细胞增殖和老化过程的影响比对椎间盘细胞外基质代谢的作用更大，在进化上是一种高度保守的信号转导通路，能够调节椎间盘细胞的自我更新，参与细胞凋亡、生长、增殖、分化以及代谢等广泛的生物学过程， 与调控基因表达、细胞黏附、细胞行为和细胞极性均有关[11]，以不同的基质调控着诸多的生命过程，这些功能对调控椎间盘退变有生物学意义。其作用机制是：Wnt 蛋白作用于细胞膜上的受体， 信号传入细胞后，Wnt 信号抑制GSK-3β，中断β-连环蛋白(β-catenin)的降解，细胞质内游离的β-catenin 含量增加，异位进入细胞核，作用于T 细胞因子/淋巴样增强因子(Tcell factor/lymphocyte enhancerfactor，TCG/LEF)，形成转录复合物，激活Wnt 信号途径中的靶基因，调控细胞的凋亡、生长和分化[12]。

Wnt1 是Wnt 信号通路中的关键成员之一，作为Wnt 信号通路的始动因子而发挥作用。Wnt1 蛋白高表达可激活Wnt 通路，引起胞内βcatenin 的 积 累， 同 时GSK-3β 积 累 并 进 入 细 胞核，激活下游靶基因转录，继而引起下游一系列基因的改变而发挥多种生物学效应[13]，其通过激活Wnt/β-catenin 经典通路来抑制细胞凋亡，是控制细胞生长、增殖的关键分泌信号分子，传递细胞间相互调控信息。 本研究应用Western blot 法检测Wnt1 蛋白在IVDD 中的表达水平的结果显示Wnt1 蛋白高表达，说明电针“大椎穴”可能就是通过促使Wnt1 蛋白高表达从而激活Wnt/β-catenin 经典通路来抑制细胞凋亡的。

GSK-3 是丝氨酸/苏氨酸类激酶中的一种，研究发现有GSK-3α 与GSK-3β 两个亚型， 其中GSK-3β 的生物学功能较复杂，是真核生物细胞重要信号通路的关键酶， 广泛参与机体的多种重要生命活动。 研究表明，GSK-3β 是细胞内Wnt/β-catenin、核因子-JB(nuclear factor-JB，NF-JB)等众多信号通路的主要调控酶，通过对下游核转录因子的影响参与细胞增殖和凋亡的调控[14]。国外也有研究认为GSK-3β 在Wnt 信号通路中起到开关的作用， 是决定βcatenin 磷酸化的关键激酶[15]。 研究显示，GSK-3β 的调节是双向的，当扮演“正向调控”的角色被抑制时，不可避免阻断了其“负向调控”的功能，使得Wnt/β-catenin 信号通路被激活[16]。 在正常情况下，Wnt 处于失活状态， 酪蛋白激酶1α 和GSK-3β 依次磷酸化β-catenin，蛋白酶体降解p-β-catenin，胞质中的β-catenin 始终维持较低的浓度水平， 与此同时，该降解物上的GSK-3β 能将磷酸基团加到βcatenin 氨基端的丝氨酸/苏氨酸的残基上使βcatenin 发生磷酸化； 磷酸化后的β-catenin 通过泛素化途径被蛋白酶体降解， 最终导致胞内的βcatenin 总体水平明显降低，从而抑制椎间盘退行性病变的进程[17]。

“大椎穴”为督脉上的主要穴位，位于后正中线上，第七颈椎棘突下凹陷中，又名“百劳”、“上杼”，为“手足三阳、督脉之会”穴，《针灸大成》载“大椎穴主肺胀胁满，呕吐上气，五劳七伤，乏力，温虐咳虐，气注背膊拘急，颈项强不得回顾，风劳食气，骨热，前板齿燥。 ”《难经·二十八难》曰督脉“并于脊里，上至风府，入属于脑”，依据“腧穴所在，主治所在”之理论，针刺“大椎穴”可温阳解痉，调节经络气血运行，是治疗颈椎病的主要穴位。

本研究结果显示， 电针组大鼠颈椎间盘纤维环细胞的Wnt 通路中Wnt1、GSK-3β 蛋白高表达，说明电针“大椎穴” 抑制颈椎病模型大鼠椎间盘细胞凋亡，其机制很有可能与电针影响了Wnt/β-catenin 信号通路中的关键调节因子Wnt1、GSK-3β 蛋白表达有关， 可能是调控颈椎间盘退变的的重要分子机制之一，但其具体激活通路尚待进一步研究。 本实验结果从生物分子学角度阐明了电针通过抑制颈椎间盘纤维环细胞凋亡从而达到治疗椎间盘退变性颈椎病的作用。 因此，通过干预颈椎间盘细胞凋亡途径中关键因子的表达来延缓或逆转椎间盘细胞凋亡， 可能成为治疗颈椎间盘退变的新思路。

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