参苓白术散对胃癌IV期患者外周血CD4+CD25+Tregs的影响

周 波，戴飞跃

（湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410007）

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，其死亡率高居癌症死因的第2 位［1］。 然而人们却不太注重胃癌的早期筛选，当发现胃癌时患者往往处于临床IV 期。对于该部分患者，美国国立综合癌症网络公布的胃癌NCCN 指南建议其接受多学科参与的综合性治疗，而中医药是肿瘤综合治疗不可或缺的部分。 参苓白术散是治疗晚期胃癌脾胃气虚型患者的有效方剂，它通过健脾益胃增强脾胃功能，提升整体抗癌机能［2］。但其具体的作用机制仍未得到阐明。近年来，CD4+CD25+Tregs 介导的肿瘤免疫逃逸机制在胃癌中得到证实［3］。因此，本研究通过前瞻性临床应用基础研究， 探明参苓白术散能否对胃癌IV 期患者外周血CD4+CD25+Tregs 和相关细胞因子产生影响，阐述其疗效机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院2012年3月至2013年9月住院治疗的40 例经胃镜或手术病理证实的胃癌患者。 参照2010年国际抗癌联盟／美国癌症联合委员会（UICC／AJCC）分期标准进行胃癌TNM 分期，均为临床IV 期。 随机分为2 组。 对照组：男12 例，女8例；年龄42～66 岁，平均（54.0±3.7）岁；分化程度：低分化13 例，中分化7 例；肿瘤部位：贲门及胃底3例，胃体2 例，幽门及胃窦15 例；观察组：男11 例，女9 例；年龄45～70 岁，平均（57.5±4.0）岁；低分化11 例，中分化9 例；贲门及胃底5 例，胃体3 例，幽门及胃窦12 例。 两组一般资料无统计学差异 （P＞0.05），具有可比性。

1.2 纳入标准

符合胃癌IV 期的诊断及分期标准［4］；符合晚期胃癌脾胃气虚中医证候诊断标准［5］；无严重的心、肝、肾、脑等脏器功能损害；无急慢性肝炎，无免疫系统疾病，近期未使用免疫抑制剂；对本研究内容知晓，并签署知情同意书。

1.3 排除标准

未按规定疗程服药者；有严重并发症如重症感染、胃出血、胃穿孔、胃肠梗阻。

1.4 治疗方法

对照组予对症支持治疗，主要采用静脉营养支持治疗：静脉用氮0.15 g/（kg·d），非蛋白质热量为28 kcal/kg，并且补充维生素和微量元素等。 观察组在对症支持治疗的同时予参苓白术散， 方药组成：人参6 g，白术10 g，茯苓10 g，白扁豆10 g，砂仁10 g， 山药10 g， 薏苡仁10 g， 桔梗10 g， 莲子10 g， 甘草3 g。 常规水煎2 次， 每日2 剂， 每剂200 mL（含生药0.4 g/mL），温服，共4 周。患者在治疗期间忌食生冷油腻、辛辣之品，禁烟酒，停服其他药物。

1.5 观察指标及检测方法

患者治疗前及治疗后第4 周晨起空腹抽取上肢静脉血2 mL，EDTA 抗凝，共3 管。

1.5.1 外周血CD4+CD25+Tregs 含量 采用FCM方法， 流式细胞仪检测，Cellquest 软件数据分析，记录阳性细胞百分率。

1.5.2 Foxp3 mRNA 表达水平 逆转录-多聚合酶链反应（RT-PCR）紫外分光光度计定量总RNA，调整浓度为：1 μg/μL。 按cDNA 第一链反应试剂盒说明采用随机引物法合成cDNA。用GAPDH 作为内行参照行PCR 定量检测（Foxp3/GAPDH×1000）。Foxp3引物序 列为： 上游：5’-GCTGGTCGG-GA GAAGAGGAAAA -3’， 下 游：5’ -CAGTATCCCACGGAAATAACCT-3’，扩增长度：433 bp。GAPDH 引物序列为：上游：5’-AACGGATTTGGTATTG-3’，下游：5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’，扩增长度：208 bp。PCR 参数：94 ℃5 min 变性；94 ℃35 s，52 ℃40 s，71 ℃55 s，38个循环；72 ℃延伸7 min。PCR产物于2%琼脂糖电泳，电压60 伏，55 min。 Gel ID凝胶分析系统摄片并测定分析其光密度。 计算各个样本Foxp3 表达水平。

1.5.3 IL-10、TGF-β1 测定 采用ELISA 双抗体夹心法，试剂盒由上海恒远生物技术发展有限公司提供，所有操作严格按说明书进行。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 两组治疗前后外周血CD4+CD25+Tregs 和Foxp3 mRNA 表达水平的比较

观察组治疗后外周血CD4+CD25+Tregs 含量及Foxp3 mRNA 表达较治疗前均明显降低， 差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组治疗后各项指标无明显变化（P＞0.05）。 两组治疗后比较差异有统计学意义（P＜0.05）。 见表1。

表1 两组治疗前后外周血CD4+CD25+Tregs和Foxp3 mRNA 表达水平的比较（n=20，±s）

表1 两组治疗前后外周血CD4+CD25+Tregs和Foxp3 mRNA 表达水平的比较（n=20，±s）

注：与本组治疗前比较△P＜0.05；与对照组比较*P＜0.05。 下表同。

组 别观察组对照组治疗前治疗后治疗前治疗后CD4+CD25+Tregs（%）28.87±8.45 10.12±4.32△*28.65±8.61 26.99±9.13 Foxp3 mRNA 4.42±0.43 2.18±0.26△*4.48±0.47 4.36±0.42

2.2 两组治疗前后血清IL-10 和TGF-β1 的比较

观察组治疗后血清IL-10 和TGF-β1 浓度较治疗前均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组治疗后各项指标无明显变化（P＞0.05）。 两组治疗后比较差异有统计学意义（P＜0.05）。 见表2。

表2 两组治疗前后血清IL-10 和TGF-β1 的比较（±s）

表2 两组治疗前后血清IL-10 和TGF-β1 的比较（±s）

组 别观察组对照组n 20 20治疗前治疗后治疗前治疗后IL-10（pg/L）95.74±7.34 70.56±6.77△*91.77±6.45 88.53±6.78 TGF-β1（ng/mL）18.65±3.52 10.33±3.46△*17.67±3.47 16.42±4.20

3 讨论

上世纪初，Ehrlich 等提出了肿瘤免疫的概念，随后Thomas 和Burnet 等又进一步提出了肿瘤的免疫监视理论。 随着肿瘤免疫研究的深入，学者们逐渐发现T 淋巴细胞和免疫调节细胞的平衡在机体的抗肿瘤免疫作用中发挥着重要作用。 CD4+CD25+Tregs 是一类具有免疫抑制功能的T 淋巴细胞亚群，它可以通过分泌抑制性细胞因子IL-10、TGF-β 发挥免疫负调节抑制肿瘤特异性T 淋巴细胞， 减少T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，使其逃脱免疫系统的监视。 研究表明，胃癌患者外周血中肿瘤特异性CD4+CD25+Tregs 增多， 通过抑制CD4+Th1 和CD8+T 淋巴细胞诱发肿瘤发生免疫逃逸，导致肿瘤的发生发展［6］。 近年来，CD4+CD25+Tregs 是肿瘤免疫治疗的新靶点。 本研究发现，参苓白术散干预胃癌IV 期患者后外周血CD4+CD25+Tregs 和相应细胞因子IL-10、TGF-β1 均下降， 这可改善胃癌患者体内肿瘤特异性T 淋巴细胞的抑制状态， 因此，参苓白术散具有潜在的免疫调节作用。

1995年，Sakaguchi 等率先在小鼠外周血中分离获得发挥免疫抑制功能的CD4+CD25+Tregs，该群细胞持续表达CD25（IL-2 受体α 链），被称为调节性T细胞。 随后，Fontenot 等研究小组同时报道X 染色体编码的Foxp3 转录因子(forkhead/ winged helix transcription factor，叉状头/翼状螺旋转录因子)特异性表达于CD4+CD25+Tregs，是Tregs 发育、活化、发挥功能的关键，可作为特异标志。Foxp3 是目前公认的特异性最强的Tregs 分子标志物［7］。Kryczek I 的研究表明Foxp3 是肿瘤患者和免疫缺陷性疾病患者体内的Tregs 特异性分子标志物［8］。在国内有研究表明胃癌组织中Foxp3+Tregs 的浸润是胃癌术后的独立危险因素，Foxp3+Tregs 高表达者预后很差［9］。 中药复方参苓白术散具有多种药理效应的物质成分，能对肿瘤特异性CD4+CD25+Tregs 起到干预作用。 本研究发现， 参苓白术散干预胃癌IV 期患者后外周血单个核细胞Foxp3 mRNA 减少，这很可能是其降低外周血CD4+CD25+Tregs 的原因。

中医学家临床发现晚期胃癌患者往往表现为正虚邪实的病理状态，以正虚为本，依据精气夺则虚，治法往往偏“补”。 临床上胃癌IV 期患者通过整体观和辨证施治运用参苓白术散治疗后中医证候、体力状态、生活质量及近期生存均有效改善，但是其治疗的科学内涵仍未得到阐述。 目前，肿瘤免疫逃逸机制和肿瘤的免疫治疗一直是肿瘤基础和临床研究的重点。 很多中药和中药复方（补益作用）的有效组分对机体的免疫系统具有调节作用。 本研究显示，健脾益气之参苓白术散能对胃癌患者肿瘤特异性CD4+CD25+Tregs 和其分泌的抑制性细胞因子IL-10、TGF-β1 起到抑制作用， 并能降低CD4+CD25+Tregs 的特征性标志Foxp3 的表达。 缺少核转录因子Foxp3，外周血CD4+CD25+Tregs 减少。 本研究初步阐明了参苓白术散扶正抗癌的免疫调节机制，但未探讨其量效关系、时效关系以及影响Foxp3表达的上游机制仍未清晰，有待进一步研究。

[1]Crew KD，Neugut AI，Epidemiology of gastric cancer [J]. World J Gastroenterol，2006，12(3)：354-362.

[2]张 红，苏志新.参苓白术散加味防治中晚期胃癌化疗所致毒副反应的临床观察[J].湖南中医药大学学报，2008，28(2)：51-53.

[3]Beyer M，Schultze JL. Regulatory T cells in Cancer [J]. Blood，2006，108(3)：804-811.

[4]American Joint Committee on Cancer. Cancer Staying Manual[M]. 7th ed. New York：Springer，2010.

[5]凌锡森，王行宽.中西结合内科学[M].北京：中国中医药出版社，2001：339-350.

[6]Hou J，Yu Z，Xiang R，et al. correlation between infiltration of FOXP3+ regulatory T cells and expression of B7-H1 in the tumor tissues of gastric cancer [J]. Exp Mol Pathol，2014，96(3)：284-291.

[7]Fontenot JD，Gavin MA，Rudensky AY. Foxp3 programs the development and function of CD4 +CD25 +regulatory T cells [J]. Nat Immunol，2003，4(4)：330-360.

[8]I.Kryczek，R.Liu，G. Wang，et al. FOXP3 defints regulatory T cells in human tumor and autoimmune disease [J]. Cancer Res，2009，69(9)：3 995-4 000.

[9]Shen Z，Zhou S，Wang Y，et al. Higher intrtumoral infiltrated Foxp3+ Tregnumbers and Foxp3+/CD8+ ratio are associated with adverse prognosis in resectable gastric cancer [J]. J Cancer Res Clin Oncol，2010，136(10)：1 585-1 595.