胶体金免疫层析法对呼吸道合胞病毒抗原快速检测结果分析

伊 洁， 肖 艳， 刘亚昆， 徐英春

·论著·

胶体金免疫层析法对呼吸道合胞病毒抗原快速检测结果分析

伊 洁1， 肖 艳2， 刘亚昆3， 徐英春1

目的 分析胶体金免疫层析法对呼吸道合胞病毒（RS V）抗原快速检测的灵敏度和特异度。方法 用 RS V抗原检测试剂盒（胶体金免疫层析法）对197例疑似 RS V感染患者的鼻咽抽吸物或鼻咽拭子标本进行检测，以反转录聚合酶链反应（R T-PC R）核酸检测结果为参考，比较胶体金免疫层析法对不同类型标本和不同年龄组患者的灵敏度。结果 197例患者标本中经R T-PC R检测，95例（48.2%）为阳性。以R T-PC R核酸检测结果为标准，胶体金免疫层析法的灵敏度和特异度分别是34.7%和100%。该方法对鼻咽抽吸物的阳性检出率较鼻咽拭子高（36.2%对8.6%，P＜0.01），鼻咽抽吸物标本的灵敏度明显高于鼻咽拭子（22.1%对12.6%）。RS V检出率与年龄呈负相关（P＜0.01），1岁以下患儿的阳性检出率最高（29.5%），而在＞5岁患儿中阳性检出率为0。结论 胶体金免疫层析法对1岁以下幼儿的鼻咽抽吸物中的 RS V有较好检测效果，可辅助临床进行早期筛查。但鉴于该方法灵敏度较低，且适用于5岁以下儿童，临床上还需用 R T-PC R对 RS V 进行确认和补充检测，以免漏诊。

呼吸道合胞病毒； 抗原快速检测； 胶体金免疫层析法； 反转录聚合酶链反应

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RS V）是婴幼儿急性下呼吸道感染的重要病原体之一，可引起婴幼儿尤其是新生儿较高的病死率［1］。快速检测RS V对疾病的及时诊断和预防医院感染有着非常重要的作用。目前针对 R S V的检测方法主要有病毒培养、抗原检测、病毒核酸扩增和免疫荧光等方法［2］，其中核酸扩增方法有较高的灵敏度，日渐成为 RS V 检测的主要方法之一［3-4］。核酸检测阳性并不能确证病原体的感染，而抗原的检出有助于确证病原的感染，但其灵敏度和特异度尚待评估。本研究以核酸检测结果为参考，对一种以R S V抗原检测为基础的胶体金免疫层析法试剂盒的灵敏度和特异度进行评估，为临床RS V的早期快速筛查提供可参考的数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 研究对象由3部分组成。第1部分来自于中国医学科学院病原生物学研究所2012年1—7月保存的59例患者标本，其中34份为2012年1—7月采集的诊断为肺炎的住院患儿鼻咽抽吸物标本，患儿平均年龄为7个月，其中27份为男性患儿标本，7份为女性患儿标本。剩余25份为2012年1—2月采集的诊断为上呼吸道感染的成人患者的鼻咽拭子标本，患者平均年龄36岁，其中12份为男性患者标本，13份为女性患者标本。第2部分来自于北京协和医院于2012年9月—2013年12月采集的61例诊断为肺炎的住院患者的鼻咽拭子标本，包括46例患儿和15例成人患者。患儿平均年龄为20个月，其中25份为男性患儿标本，21份为女性患儿标本。成人患者的平均年龄为55岁，其中男性患者的标本为8份，女性患者的标本为7份。第3部分为北京市大兴妇幼保健院于2013年12月采集的77例诊断为上呼吸道感染的门诊患儿标本，包括57份鼻咽拭子标本和20份鼻咽抽吸物标本。患儿平均年龄为27.1个月，其中男性患儿标本为41份，女性患儿标本为36份。采集的标本均置于3 m L病毒保存液的专用标本管中保存。

1.1.2 主要试剂 核酸提取试剂盒为 QIA G E N公司产品（QIAa m p MinElute Virus Spin Kit，Cat. 57704，德国）；反转录聚合酶链反应（R T-PC R）采用SuperScript. Ⅲ First-Strand Synthesis System（Invitrogen，Cat.18080-051，美 国）试剂；Binax N O WR S V试剂盒为美国Binax N O W 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 Binax N O WR S V检测 按照检测说明书进行操作，新采集的标本直接滴到试纸条上进行检测，冻存的标本解冻后直接滴到试纸条上进行检测，等待15 min即可观察结果，当试纸条判定部 T、C处都确认有条带时，结果判为阳性。同时将检测余下的标本分装后于-80℃低温冰箱保存，集中进行核酸检测。

1.2.2 R S V核酸检测 采用一步法R T-PC R方法进行 R S V核酸的检测［5］，P C R产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析，阳性产物进行测序验证。

1.2.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计学软件对结果进行统计分析，胶体金免疫层析试剂盒与R T-PCR的检测结果比较采用一致性检验；该试剂盒对不同类型标本的灵敏度用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义；检测结果与年龄的相关性用Spearman相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胶体金免疫层析法检测与 R T-P C R核酸检测的比较

197例疑似R S V的鼻咽拭子和鼻咽抽吸物标本，经 R T-P C R 核 酸检测确认R S V 阳性 95 例（48.2%），阴性102例（51.8%）。胶体金免疫层析法检测阳性33例（16.8%），阴性164例（83.2%）。以R S V R T-P C R核酸检测结果为标准，胶体金免疫层析法总体灵敏度为34.7%，特异度100%，阳性预测值为100%，阴性预测值为62.2%。胶体金免疫层析法检测与 R T-P C R核酸检测结果的一致率Pa值为68.5%，在检测结果无关联的假定下，期望一致率Pe值为53.9%，Kappa值为0.315，见表1。

表1 胶体金免疫层析法与 R T-PC R核酸检测结果的比较Table 1 Performance of colloidal gold im m unochro matography assay co m pared to R T-PC R for detection of respiratory syncytial virus

2.2 胶体金免疫层析法对不同类型标本灵敏度检测的结果比较

RS V抗原检测试剂盒提示可以检测鼻咽抽吸物和鼻咽拭子2种类型标本。采集的58例鼻咽抽吸物标本，经胶体金免疫层析法检测阳性21例（36.2%），阴性37例（63.8%）。139例鼻咽拭子标本中，经胶体金免疫层析法检测阳性12例（8.6%），阴性127例（91.4%），鼻咽抽吸物与鼻咽拭子阳性检测率具有明显差异（χ2=22.31，P＜0.01）。以R T-PC R核酸检测结果为标准，胶体金免疫层析法检测鼻咽抽吸物标本的灵敏度为22.1%，鼻咽拭子标本的灵敏度为12.6%，胶体金免疫层析法检测对鼻咽抽吸物的灵敏度明显高于鼻咽拭子。

2.3 胶体金免疫层析法对不同年龄组标本的检测结果比较

根据患者的年龄将197例标本分为0～＜1岁组78例，1～＜3岁组44例，3～＜5岁25例，≥5岁50例。胶体金免疫层析法的阳性率分别是29.5%，20.5%，4.0%和0，见表2。该方法的阳性率与患者的年龄呈负相关（Spearman相关系数分别为-0.33，P＜0.01），且 为线性关 系 （R2= 0.9479），见图1。

表2 胶体金免疫层析法对不同年龄组标本的检测结果Table 2 Performance of colloidal gold im m unochro matography assay in detection of respiratory syncytial virus by age group

图1 胶体金免疫层析法的阳性率与患者年龄大小呈线性关系Figure 1 Linear relationship between the positive rate of colloidal gold im m unochro matography assay and age of patients

3 讨论

胶体金免疫层析法是检测鼻咽抽吸物和鼻咽拭子样本中 R S V 融合蛋白抗原的膜免疫层析试验。标本中存在的R S V抗原与试纸条硝酸纤维素膜上的抗R S V抗体结合物结合，形成的抗原结合复合物被固定的抗R S V抗体捕获，形成可视的样本线。由于其快速、方便操作等特点，胶体金免疫层析法已经在门急诊被广泛地用于多种病毒的检测。阳性结果对于快速诊断疾病，避免不必要的使用抗菌药物等都有极大的帮助［6-8］。但是抗原检测结果受很多因素的限制，包括灵敏度和特异度、被检测患者的年龄、标本的类型、疾病的流行状况等。有国外文献报道，胶体金免疫层析法检测 R S V 的灵敏度为74%～89%［9-11］。本研究以P C R 核酸检测结果为标准，胶体金免疫层析法的灵敏度为34.7%，与P C R检测一致性较差（Kappa＜0.4），说明该方法的灵敏度存在一定的局限性。

本研究中胶体金免疫层析法的灵敏度低于文献报道的原因可能有：①采集标本中有鼻咽拭子和鼻洗液，而文献研究以鼻洗液或鼻咽吸取物为主［12-13］。本研究对2种类型标本的灵敏度进行了分析，结果发现鼻洗液的灵敏度明显高于鼻咽拭子（36.2%对8.6%，P＜0.01），而197例标本中鼻咽拭子标本占了70%，可能是导致胶体金免疫层析法灵敏度较低的一个原因；②采集的标本患者的年龄从0～80岁，而 Mierny等［12］报道的采集标本患儿的平均年龄为9.3～12.9个月，因此将患者分成为0～＜1岁，1～＜3岁，3～＜5岁和≥5岁4组，结果发现随着年龄的增长，胶体金免疫层析法的阳性率有所降低，即该方法的阳性率与患儿的年龄呈负相关（Spearman相关系数分别为-0.33，P＜0.01），且为线性关系（R2=0.948）。

尽管胶体金免疫层析法的灵敏度较低，但其特异度为100%，与国外报道的97%～100%［11-13］结果基本一致。该方法阳性预测值为100%，阴性预测值为62.2%，因此当该试剂盒检测为阳性时，基本可以确定为RS V感染，而检测为阴性时则需要进一步确认，例如用R T-PC R或者病毒培养来排除假阴性。胶体金免疫层析法适用于新生儿或5岁以下儿童呼吸道合胞病毒感染的体外诊断，不适用于成人，这可能成为该方法广泛应用的一个限制性因素。

免疫层析技术与临床常用的直接免疫荧光法有很好的符合率［14］。本研究结果表明，尽管胶体金免疫层析法的灵敏度有一定的局限性，但是其在1岁以下幼儿的鼻洗液中较高时仍有较好的检测效果，该方法操作简便，需时较短，不需要特殊的仪器设备，易被门急诊及基层医院所接受，可用于早期新生儿及儿童RS V感染的辅助诊断。

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Performance of colloidal gold im m unochromatography assay in rapid detection of respiratory syncytial virus antigen

YI Jie，XIA O Yan，LIU Yakun，X U Yingchun. （Department of Laboratory M edicine，Peking U nion M edical College H ospital，Beijing 100730，China）

Objective To investigate the sensitivity and specificity of colloidal gold im m unochro matography assay in rapid detection of respiratory syncytial virus （RS V）antigen.M ethods A total of 197 nasal-pharyngeal swabs （N Ps）or nasalpharyngeal aspirates （N P As） obtained fro m patients were tested by RS V assay kits，i.e.， colloidal gold im m unochro matography assay.The results determined by reverse-transcription poly merase chain reaction （R T-PC R）were taken as reference.Co m pared to the results of R T-PC R，the sensitivity of the kit was different w hen testing different types of specimens or specimensobtained fro m patients of different ages.Results A total of 95（48.2%）sam ples were positive for RS V tested by R T-PC R.The sensitivity and specificity of colloidal gold im m unochro matography assay were 34.7% and 100%，respectively co m pared with R T-PC R results.The positive rate of the assay was higher in testing N P As than N Ps（36.2%vs 8.6%，P ＜0.01），w hich was the same in the sensitivity （22.1% vs 12.6%）.The positive rate of colloidal gold im m unochro matography assay showed negative correlation with the age of patients（P＜0.01），w hich was highest in children less than one-year old（29.5%）but zero in patients m ore than five-year old.Conclusions The colloidal gold im m unochro matography assay is effective in early detection of RS V fro m N P As in children less than one-year old.It can be used in early diagnosis for children infected with RS V. Since colloidal gold im m unochro matography assay has so me limitations，and itis only suitable for the children under five-year old，R T-PC R method should be used for RS V detection in clinical practice to avoid missed diagnosis.

respiratory syncytial virus；rapid antigen test；colloidal gold im m unochro matography assay；reverse transcription poly merase chain reaction

R373

A

1009-7708（2015）01-0024-04

2014-02-27

2014-06-16

国家科技重大专项课题（2012Z X10004-206）。

1.中国医学科学院北京协和医院检验科，协和转化医学

中心，北京 100730；

2.中国医学科学院病原生物学研究所；3.北京市大兴区妇幼保健院。

伊洁（1983—），女，博士，研究实习员，主要从事病原微生物及肿瘤分子诊断。

徐英春，E-mail：xycpu mch@aliyun.co m。