2009—2013年血液标本病原菌耐药性监测

周碧云， 朱旭慧， 陈中举， 田 磊， 闫少珍， 孙自镛

·论著·

2009—2013年血液标本病原菌耐药性监测

周碧云， 朱旭慧*， 陈中举*， 田 磊*， 闫少珍*， 孙自镛*

目的 了解2009—2013年武汉同济医院血液标本病原菌的构成、病原谱的变化及其对常用抗菌药物的耐药情况。方法 病原菌按照常规方法进行鉴定和药敏试验。布鲁菌属进行PC R扩增和测序。结果 共分离病原菌2 152株（不包括凝固酶阴性葡萄球菌），其中革兰阳性菌761株，占35.4%，革兰阴性菌1 242株，占57.7%。真菌149株，占6.9%。最常见的革兰阳性菌为金黄色葡萄球菌（金葡菌）、屎肠球菌和粪肠球菌；革兰阴性菌为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和布鲁菌属。2009年首次分离出1株羊布鲁菌，但2013年增加到50株（其中1株为猪布鲁菌），占当年血液标本分离菌的7.1%。耐甲氧西林金葡菌（M RS A）检出率为54.1%，未检出对万古霉素和利奈唑胺耐药的葡萄球菌。粪肠球菌对氨苄西林和左氧氟沙星耐药率较低，在30%以下；屎肠球菌除糖肽类和利奈唑胺外，对其余抗菌药物的耐药率均在70%以上；大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、头孢西丁和头孢哌酮-舒巴坦耐药率在15%以下。出现了对碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌（C R E），以阴沟肠杆菌多见。铜绿假单胞菌对常用抗菌药物保持了较高的敏感性，但鲍曼不动杆菌耐药现象严重，除头孢哌酮-舒巴坦外，对其余抗菌药物的耐药率均在60%以上。结论 大肠埃希菌和金葡菌仍是血流感染中最常见病原菌，布鲁菌属检出率逐年增高，应引起重视。此外，血液标本病原菌对常用抗菌药物有不同程度的耐药性，应根据药敏试验结果合理选用抗菌药物。

血液标本； 耐药性； 监测

血流感染是临床上常见的重症感染性疾病，随着创伤性治疗技术的广泛开展、免疫缺陷人群的出现及抗菌药物的广泛使用，发病率呈逐年增高的趋势［1］。注意无菌操作、早期发现病原菌、及时正确地使用抗菌药物对患者的治疗和预后起着至关重要的作用。本研究总结了近5年华中科技大学同济医学院附属同济医院血流感染的病原菌构成及耐药情况，并分析病原谱的变化，为血流感染患者的经验治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 2009年1月1日—2013年12月31日我院血培养分离出的病原菌，剔除同一患者相同部位的重复分离菌株。

1.1.2 仪器和试剂 BacT/Alert 3D和B A C T E C 9240血培养仪分别购自法国生物梅里埃公司和美国B E C T O N DIC KIN S O N 公司。A PI和 VIT E K2 Co m pact细菌鉴定系统为法国生物梅里埃公司产品。抗菌药物敏感性试验纸片和各种培养基为英国O X OID公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离鉴定和药敏试验 细菌分离与鉴定按全国临床检验操作规程进行［2］，所有菌株（除外布鲁菌属）均采用自动化细菌鉴定仪 VIT E K2 Co m pact或A PI鉴定系统以及结合手工生化结果进行菌种鉴定。肺炎链球菌对青霉素和头孢曲松以及金黄色葡萄球菌（金葡菌）对万古霉素的敏感性采用E试验法检测，其余抗菌药物敏感性试验采用纸片扩散法，若出现糖肽类和碳青霉烯类耐药，则用E试验法进行确认。

1.2.2 布鲁菌属的检测

1.2.2.1 宽范围PC R扩增 参照文献设计引物并进行PC R扩增［3］，引物由上海英骏公司合成。

1.2.2.2 测序 PC R产物送至上海英骏公司进行测序，结果与B L A S T比对。

1.2.3 质控菌株

1.2.3.1 生化鉴定仪质控菌株 G N鉴定板-嗜麦芽窄食单胞菌A T C C 17666，G P鉴定板-酪黄肠球菌 A T C C 700324，A PI 20C-白 念 珠 菌 A T C C 90028，每月1次。

1.2.3.2 药敏质控菌株 金葡菌 A T C C 25923（纸片法）、A T C C 29213（E试验法）、大肠埃希菌A T C C 25922、A T C C 35218、肺炎克雷伯菌A T C C 700603、铜绿假单胞菌 A T C C 27853、肺炎链球菌A T C C 49619和白念珠菌A T C C 90028。药敏试验结果参照C LSI 2012年标准。

1.2.4 统计学分析 所有数据均使用W H O N E T 5.6软件统计分析。

2 结果

2.1 细菌构成

共分离出病原菌2 152株（不包括凝固酶阴性葡萄球菌），其中革兰阳性菌761株，占35.4%；革兰阴性菌1 242株，占57.7%；真菌149株，占6.9%。5年中，革兰阳性菌分离率为33%～36%，革兰阴性菌分离率为53%～60%，变化不明显。但布鲁菌检出率逐年增高，2009年我院首次分离出1株羊布鲁菌，但2013年分离出50株（其中1株为猪布鲁菌），占当年分离菌的7.1%。见表1。最常见的病原菌依次为大肠埃希菌、金葡菌、肺炎克雷伯菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和粪肠球菌。苛养菌检出率不高，主要是肺炎链球菌34株（1.6%），流感嗜血杆菌1株，β溶血链球菌13株（0.6%）。

表1 2009—2013年血流感染主要病原菌构成Table 1 Species distribution of the microorganisms isolated fro m blood specimens［n（%）］

2.2 细菌耐药性分析

2.2.1 葡萄球菌属 耐甲氧西林金葡菌（M RS A）的检出率为54.1%。M R S A对甲氧苄啶-磺胺甲口恶唑耐药率较低，为1.3%。甲氧西林敏感金葡菌（M SS A）除对红霉素耐药率为41.3%外，对其余抗菌药物的耐药率均较低。未发现对万古霉素和利奈唑胺不敏感的葡萄球菌属细菌。见表2。万古霉素对金葡菌的 MIC50为1.0 mg/L，MIC90为1.5 mg/L。

2.2.2 肠球菌属 粪肠球菌对氨苄西林仍保持较高敏感性，敏感率为81.2%。屎肠球菌仅对利奈唑胺和替考拉宁保持高度敏感，耐药率分别为0和1.4%。未发现对万古霉素耐药的粪肠球菌，但万古霉素耐药屎肠球菌高达11.7%。见表3。

2.2.3 常见肠杆菌科细菌 大肠埃希菌是血液标本中最为常见的肠杆菌科细菌之一，其次是肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌。大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、头孢西丁和头孢哌酮-舒巴坦耐药率在15%以下。此外，肺炎克雷伯菌对左氧氟沙星耐药率也低于10%。阴沟肠杆菌对阿米卡星、左氧氟沙星、头孢吡肟、头孢哌酮-舒巴坦和哌拉西林-他唑巴坦耐药率低于30%。出现了对碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌（C R E），以阴沟肠杆菌多见。见表4。

2.2.4 常见不发酵糖革兰阴性杆菌 铜绿假单胞菌对常用抗菌药物保持了较高的敏感性，除对替卡西林-克拉维酸、甲氧苄啶-磺胺甲口恶唑和米诺环素耐药率高（＞40%）外，对其他常用抗菌药物耐药率均在30%以下。鲍曼不动杆菌耐药现象严重，除对头孢哌酮-舒巴坦耐药率在40%以下，对其余抗菌药物耐药率均在50%以上。见表5。

表2 金葡菌对常用抗菌药物的耐药率和敏感率Table 2 Susceptibility of theStaphylococcus aureusisolates to the co m m only used antimicrobial agents（%）

表3 粪肠球菌和屎肠球菌对常用抗菌药物的耐药率和敏感率Table 3 Susceptibility of theE.faecalisandE.faeciu misolates to the co m m only used antimicrobial agents（%）

表4 大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌对常用抗菌药物的耐药率和敏感率Table 4 Susceptibility of theE.coli，K.pneu moniaeandE.cloacaeisolates to the co m m only used antimicrobial agents（%）

表5 铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌对常用抗菌药物的耐药率和敏感率Table 5 Susceptibility of theP.aeruginosaandA.bau m anniiisolates to the co m m only used antimicrobial agents（%）

3 讨论

尽管新型抗菌药物不断出现，但临床血流感染并未见明显减少，感染率呈逐年上升趋势［4］。血培养是诊断血流感染的重要依据，因此了解血培养病原菌的构成和耐药性变迁，对有效控制血流感染显得极为重要。

本监测结果显示，血流感染最常见的革兰阳性病原菌为金葡菌、屎肠球菌和粪肠球菌；最常见的革兰阴性病原菌为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和布鲁菌属，与我们之前报道的资料相比较有所变化［5］。2013年布鲁菌属细菌感染逐年上升，占血液标本病原菌构成的7.1%。布鲁菌病是一种人畜共患病，全球年新发病例数为50万［6］。上世纪90年代以来。国内25个省市有人畜布鲁菌病疫情，西部、东北及华北地区疫情较严重［7］。湖北省地处中部，非疫区，但近年来发病率逐年上升，患者除畜牧业人员外，有医务人员、武警战士、司机等。这可能与我国检疫制度不健全，群众自我防护意识淡漠等有关［7］。应引起广大医务人员广泛关注，并加强对此病的防范和诊治。

本次监测数据显示，我院血流感染的金葡菌中M RSA的检出率相当高，为54.1%，给临床经验治疗带来极大的挑战，庆幸的是，未发现对万古霉素和利奈唑胺不敏感的金葡菌。肠球菌属也是引起血流感染重要的革兰阳性菌，常继发于尿路、盆腔和腹腔感染［8］，主要包括粪肠球菌和屎肠球菌。万古霉素耐药肠球菌有逐年上升趋势，从2009年的约4%升至2013年约8%。均为VanA基因型，未检出VanB和VanC菌株。分离自血液标本的凝固酶阴性葡萄球菌大部分为污染菌，因临床资料有限（患者往往只送一套甚至是一瓶血培养），故本文未对凝固酶阴性葡萄球菌进行统计。

血流感染最常见的革兰阴性杆菌是大肠埃希菌，其次是肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌。大肠埃希菌血流感染多继发于尿路、肠道等感染，肺炎克雷伯菌和肠杆菌属细菌等血流感染则多获自医院内［8］。这3种常见的肠杆菌科细菌，除对碳青霉烯类抗生素外，对阿米卡星、哌拉西林-他唑巴坦和头孢哌酮-舒巴坦的耐药率均在30%以下。本研究检出了C R E，尤其是阴沟肠杆菌耐药现象比较严重。2009年我们检出第1株C R E，2013年增加到15株，基因型主要为I M P-4和N D M-1。临床上遇 C R E感染应慎用碳青霉烯类抗生素。

血流感染分离的不发酵糖革兰阴性杆菌主要是铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌。铜绿假单胞菌血流感染在重症监护病房患者中更为常见，患者往往有严重免疫缺陷或严重原发病，且常继发于呼吸机相关性肺炎，病情凶险，病死率高。分离自血培养的铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药率为20%～30%，对常用抗菌药物，如哌拉西林-他唑巴坦、头孢他啶、头孢吡肟、哌拉西林、头孢哌酮-舒巴坦、阿米卡星、妥布霉素、左氧氟沙星和环丙沙星的耐药率均在30%以下。鲍曼不动杆菌血流感染患者大多有严重的基础疾病，多系医院获得性感染，其耐药性较铜绿假单胞菌严重。鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类耐药率高达70%以上，治疗相当困难，临床可考虑联合用药。

本次监测检出肺炎链球菌34株，占1.6%，β溶血链球菌13株，占0.6%。血培养苛养菌检出率低的原因可能有：①与抗菌药物的使用有关，血流感染往往比较凶险，患者在进入大型综合性医院前，已大量使用抗菌药物。病原菌被抑制而无法得到阳性培养结果。②苛养菌的培养条件相对苛刻，如消毒不严格，混有杂菌生长，苛养菌无法得到适当的营养呈假阴性。③血培养瓶采集后未立即送往实验室，任何延误送入自动连续监测血培养仪的行为，都会延误或阻止检测细菌的生长。因此，应重视标本采集处理的各个环节，提高检出率。

综上所述，血流感染的病原菌种类多，耐药菌检出率高，涉及的环节也很多。因此，实验室应重视血培养的全程控制，包括对医护人员的培训，分析前、分析中和分析后各个环节的管理，为合理使用抗菌药物提供科学依据。

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［7］ 周艳彬，柳晓琳.布鲁氏菌病的流行、发病原因及防治进展［J］.辽宁医学院学报，2010，31（1）：81-85.

［8］ 李光辉，朱德妹，汪复，等.2011年中国C HIN E T血培养临床分离菌的分布及耐药性［J］.中国感染与化疗杂志，2013，13（4）：241-247.

Antimicrobial resistance surveillance in the microorganisms isolated from blood specimens：a five-year analysis from 2009 to 2013

Z H O UBiyun，Z H UX uhui，C H E NZhongju，TIA NLei，Y A N Shaozhen，S U NZiyong.
（Department of Laboratory M edicine，Tongji H ospital，Tongji M edical College，H uazhong University of Science and Technology，W uhan 430030，China）

Objective To investigate the distribution，variability and antibiotic resistance of the pathogen sisolated fro m bloodstream infections.M ethods The bacterial strains were routinely isolated fro m blood sam ples and identified.Brucellatrains were identified by PC R and gene sequencing.A ntimicrobial susceptibility were routinely tested for these isolates.Results A total of 2 152 strains，excluding coagulase negativeStaphylococcus，were isolated fro m blood specimens during the 5-year period fro m 2009 through 2013.Gram-positive cocci，gram-negative bacilli and fungi accounted for 35.3% （761/2 152），57.7% （1 242/2 152）and 6.9% （149/2 152），respectively.The top three gram-positive bacteria wereS.aureus，E.faeciu m andE.faecalis.E.coli，K.pneu moniae，P.aeruginosa，A.bau m annii，andBrucellawere the m ost frequently isolated gram-negative bacteria.In 2009，only oneBrucella melitensiswas isolated，butincreased to 50 in 2013（7.1%），including one strain ofBrucella suis.The prevalence of M RS A was 54.1%inS.aureus.No staphylococcal isolate was found resistant to vanco m ycin or linezolid.M ore than 60% of theE.faecalisisolates still showed low resistance（＜ 30%）to am picillin and levofloxacin.ButE.faeciu mstrains were highly resistant to m ost antibiotics（＞70%）except glycopeptides and linezolid.E. coliandK.pneu moniaeisolates displayed low resistance rate（＜15%）to piperacillin-tazobactam，amikacin，cefoxitin and cefoperazone-sulbactam.Carbapenem-resistantEnterobacteriaceae strains were identified，especially inEnterobacter cloacae. P.aeruginosaisolates were still susceptible to the co m m only used antibiotics，butA.bau m anniiisolateswere highly resistant（＞60% resistant）to all the co m m only used antibiotics except cefoperazone-sulbactam.ConclusionsO ur five-year surveillance data indicated thatE.coliandS.aureuswere still the m ost co m m on pathogens in blood stream infections.Attention should be paid to the increasing prevalence of Brucellain blood stream infections.Various levels of antibiotic resistance are found in the pathogens of blood stream infections.A ntibiotics should be prescribed reasonably according to local susceptibility testing data.

blood stream infection；antibiotic resistance；surveillance

R378

A

1009-7708（2015）01-0001-05

2014-04-28

2014-07-24

湖北省自然科学基金项目（2013C FB172）。

华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉科，武汉430030。*检验科。

周碧云（1971—），女，硕士，主治医师，主要从事感染学研究。

朱旭慧，E-mail：zhuxuhui2002@163.co m。