临床分离广泛耐药鲍曼不动杆菌同源性分析及常见耐药基因检测

孙 晴， 张正银

·论著·

临床分离广泛耐药鲍曼不动杆菌同源性分析及常见耐药基因检测

孙 晴， 张正银

目的 了解上海市同仁医院临床分离广泛耐药鲍曼不动杆菌的基因同源性及耐药机制，为广泛耐药鲍曼不动杆菌感染的防治提供依据。方法 采用肠杆菌科基因间重复序列聚合酶链反应（E RIC-PC R）对临床分离的28株广泛耐药鲍曼不动杆菌进行分子生物学分型，采用PC R方法检测9种常见β内酰胺酶基因：blaK PC、blaI M P、blaVI M、blaN D M-1、blaO X A-23、blaO X A-24、blaO X A-48、blaO X A-51和blaO X A-58；膜孔蛋白基因CarO；插入序列IS Aba1；以及IS Aba1-O X A23、IS Aba1-O X A58的连锁检测。结果 28株临床分离的广泛耐药鲍曼不动杆菌大多来自危重患者呼吸道标本，E RIC-PC R基因分型提示为同一来源克隆株；所有菌株均携带blaO X A-23、blaO X A-51基因，未检测出 B类β内酰胺酶基因，以及blaO X A-24、blaO X A-48、blaO X A-58等基因；膜孔蛋白基因CarO和插入序列IS Aba1检测均为阳性，IS Aba1-O X A23、IS Aba1-O X A58连锁检测均未扩增到预期条带。结论 研究期间临床分离广泛耐药鲍曼不动杆菌为同一克隆株，且携带相同耐药基因，提示存在克隆传播。

广泛耐药； 鲍曼不动杆菌； 同源性； 耐药基因

鲍曼不动杆菌（Acinetobacter bau m annii）在环境中广泛存在，因其具有极强的生存、黏附以及获得外源性耐药基因的能力，成为医院感染常见的机会致病菌。近年来，随着抗菌药物的广泛使用，以及机械通气和介入治疗等侵袭性操作应用，鲍曼不动杆菌成为我院临床分离率最高的不发酵糖革兰阴性杆菌，与上海地区耐药监测网的数据相符［1］。我院统计数据显示，2011至2013年广 泛耐 药鲍曼不动杆菌（X D R A B）的检出率不断上升，分别为5.1%（17株/336株）、6.7%（19株/282株）和14.5%（31株/214株）。可见，该菌的医院感染问题日益严重。为了解我院X D R A B分子流行病学及部分常见耐药基因型特征，本研究对临床非重复分离的28株 X D R A B进行基因同源性及部分常见耐药基因的检测分析，以期发现X D R A B传播以及产β内酰胺酶特点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 收集2013年2—10月我院临床分离的鲍曼不动杆菌167株（剔除同一患者中分离的重复菌株）。

1.1.2 主要试剂 鲍曼不动杆菌鉴定板条 G N及药敏板条G N13为法国生物梅里埃公司产品。药敏纸片为英国O X OID公司产品。质控菌株为大肠埃希菌 A T C C 25922、A T C C 35218，铜绿假单胞菌A T C C 27853。检测用PC R试剂（Reco m binant Taq D N A Poly merase）为宝生物（大连）公司产品。

1.2 方法

1.2.1 药敏试验 采用 VIT E K2 Compact系统对病原菌进行鉴定及最低抑菌浓度（MIC）测定，采用纸片扩散法（K-B法）测定抑菌圈直径，并根据美国临床实验室标准化协会（CLSI）2012年M 100-S22标准判定细菌耐药性，测试抗菌药物为哌拉西林、氨苄西林-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦、头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟、头孢吡肟、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、甲氧苄啶-磺胺甲口恶唑、米诺环素和多黏菌素B，共17种。1.2.2 细菌D N A 模板制备 挑取1～2个菌落，加入0.5 m L T E（10 m m ol/L Tris-H Cl，1 m m ol/L E D T A p H 8.0）中混匀，100℃水浴10 min，5 000 g离心5 min取上清液备用。

1.2.3 耐药基因检测 各类β内酰胺酶基因PCR检测引物根据文献报道序列合成［2-4］，CarO 基因检测引物根据GenBank公布序列自行设计，见表1。PCR反应体系总体积均为50μL，其中D N A 模板5μL，10×PC R buffer 5μL，dN TPs（各2.5 m mol/L）4μL，引物（20μmol/L）0.5μL，Taq酶（5 u/μL）0.25μL，最后dd H2O补充至50μL；反应参数均为94℃ 预变性5 min，进入循环94℃25 s，52℃40 s，72℃50 s共35个循环，最后72 ℃延伸6 min。IS Aba1F分别与O X A23R、O X A51R 组 合 扩 增 IS Aba1-O X A23、IS Aba1-O X A58连锁检测，扩增循环的延伸时间为4 min。扩增阳性产物送上海迈普生物技术公司测序，测序结果与GenBank数据库中序列进行比对。

表1 PC R引物序列Table 1 Primer sequences used in PC R

2 结果

2.1 菌株来源和分布

2.1.1 标本种类来源 167株鲍曼不动杆菌中有28株对除多黏菌素B外的临床常用16种抗菌药物均耐 药，广泛耐 药 株检 出率 为 16.8%。28 株X D R A B大多分离自呼吸道标本，见表2。

表2 鲍曼不动杆菌的临床标本来源分布Table 2 Distribution ofAcinetobacter bau m annii isolates by clinical specimen

2.1.2 科室分布 28株X D R A B来源为急诊重症监护病房（IC U）15株，神经外科6株，消化内科3株，呼吸科2株，神经内科1株，心内科1株。

2.2 基因检测结果

28株X D R A B的E RIC-P C R基因分型结果显示均为同一克隆株，均未检测出 A类β内酰胺酶K PC 基因 和B 类 β内 酰胺 酶基 因I M P、VI M、N D M-1，均携带有blaO X A-23、blaO X A-51基因，未检测出blaO X A-24、blaO X A-48、blaO X A-58基因，插入序列IS Aba1及膜孔蛋白基因CarO检测均为阳性，IS Aba1-O X A23、IS Aba1-O X A58连锁检测均未扩增到预期条带。

3 讨论

近年来，鲍曼不动杆菌因其不断升高的耐药率以及医院感染的高发率被称为“革兰阴性菌中的M RS A”。在分子流行病学研究中，脉冲场凝胶电泳（PF G E）是细菌分子生物学分型方法的“金标准”，但其设备价格昂贵、试验周期长、操作技术要求高。本研究采用的E RIC-PC R是一种成本低、操作简便快速、分 辨 效果 较好、可 重复 性好 的方 法，且与PF G E 结果 一致性 高［5］。本次 28 株 X D R A B 的E RIC-P C R基因分型结果显示条带一致，提示为同一克隆株。

本研究收集临床分离的28株 X D R A B主要来源于急诊IC U 以及神经外科，其他科室为散在分布。标本来源以呼吸道为主，提示感染部位多发生在下呼吸道。本组82%患者为60岁以上老年人，免疫功能低下，经调查发现这些急诊IC U 和神经外科患者均有气管插管、机械通气史，这可能是造成克隆株传播、流行的主要原因，与厉世笑等［6］的报道相似。另外发现，急诊IC U和神经外科的部分床位短期内2次先后从不同患者标本中分离出 X D R A B，提示患者出院后“终末消毒”可能不够彻底，未能完全杀灭X D R A B。

鲍曼不动杆菌产生的碳青霉烯酶主要为blaO X A-23、blaO X A-24、blaO X A-51和blaO X A-58型 等 D 类酶［7］。 本组X D R A B 全部 携带 有blaO X A-23，blaO X A-51 基 因，均 未 检 测 出blaO X A-24、blaO X A-48、 blaO X A-58。 携 带blaO X A-23基因是国内报道鲍曼不动杆菌耐药的主要机制，而blaO X A-51常为鲍曼不动杆菌天然携带［8］。膜孔蛋白CarO的缺失也与耐碳青霉烯类药物具有相关性［9］。而本组菌株均无CarO 基因缺失，故对碳青霉烯类耐药与膜孔蛋白基因缺失无关，但不能排除基因表达降低或是突变引起的耐药性增加。插入序列是最为简单的转座子，可携带传递β内酰胺酶基因、氨基糖苷类修饰酶基因、16SrR N A甲基化酶基因、喹诺酮作用靶位保护蛋白基因、外排泵基因等耐药基因［10］。甚至IS Aba1插入CarO 基因，致膜孔蛋白CarO基因失活对碳青霉烯类药物耐药［11］。IS Aba1作为一种鲍曼不动杆菌特有的插入序列，常伴随blaO X A-23、blaO X A-51出现，并为其基因表达提供强启动子［12］。本研究分离 X D R A B菌株均 检测 出插 入序 列IS Aba1，但IS Aba1-O X A23、IS Aba1-O X A58的连锁检测并未扩增到预期条带，提示两者不是直接连锁，但并不能除外间接相邻，可能与其他耐药性的形成具有一定相关性。

总之，E RIC-P C R基因分型以及耐药基因的检测结果均显示，我院分离的28株X D R A B具有高度的相似性，亲缘关系紧密，为同一克隆株，提示我院存在 X D R A B 的 克隆传 播，且 携 带blaO X A-23、blaO X A-51基因是引起其高耐碳青霉烯类药物的主要原因之一。临床上医务人员必须严格执行无菌操作以及环境的消毒，加强对感染或定植患者的监测及隔离，避免在医院内的进一步传播。此外，在治疗各种感染时，尽量参考药敏结果合理选用抗菌药物。同时应加强鲍曼不动杆菌的耐药监测，及时报告耐药表型，定期对监测结果进行总结并通报临床，以便临床医师和感染防控人员采取及时、有效的干预措施，以减少细菌耐药性的产生与传播。

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Analysis of the genetic homology and resistant genes in clinical isolates of extensively drug-resistantAcinetobacter baumannii

S U N Qing，Z H A N G Zhengyin. （Department of Laboratory M edicine，Tong Ren H ospital，Shanghai 200336，China）

Objective To investigate the genetic ho m ology in clinical isolates of extensively drug-resistantAcinetobacter bau m annii（X D R A B），so as to provide evidence for better controlling hospitalinfections.M ethods The genotypes of 28 clinical X D R A B isolates were determined by Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PC R （E RIC-PC R）.PC R was conducted to analyze 9 types ofβ-lactamase genes（blaK PC，blaI M P，blaVI M，blaN D M-1，blaO X A-23，blaO X A-24，blaO X A-48，blaO X A-51 andblaO X A-58），the outer mem brane porin gene（CarO）and insertion sequence（IS）IS Aba1.W e also carried out linkage analysis forIS Aba1-O X A23 andIS Aba1-O X A58.Results M ost of the above 28 X D R A B strains were isolated fro m respiratory tract specimens fro m intensive care patients.The result of E RIC-PC R showed that there was high ho m ology between all the strains，suggesting that they might derive fro m the same clone.The genesblaO X A-23，blaO X A-51，CarOand the ISIS Aba1 except Class Bβ-lactamase genes，blaO X A-24，blaO X A-48，blaO X A-58，IS Aba1-O X A23 andIS Aba1-O X A58 were detected in all the clinical strains by PC R.Conclusions All the X D R A B isolates belong to the same clone and carry the same drug-resistant genes，indicating that there was clone spread am ong X D R A B isolates.

extensively drug-resistant；Acinetobacter bau m annii；ho m ology；drug-resistant gene

R378

A

1009-7708（2015）01-0028-04

2014-03-11

2014-06-27

上海市同仁医院检验科，上海 200336。

孙晴（1979—），女，主管技师，主要从事微生物检验和细菌耐药性研究。

张正银，E-mail：zhangzy08@163.co m。