1个青少年发病的成人型糖尿病2型家系的基因突变分析

乐昊 任蕾 郭丰 秦贵军

(郑州大学第一附属医院 内分泌科 河南 郑州 450052)

青少年发病的成年型糖尿病(maturity -onset diabetes of the young，MODY)是一种常染色体显性遗传的特殊类型糖尿病，以发病年龄早(通常＜25 岁)、胰岛β 细胞功能缺陷为特征［1］。迄今为止，已发现14 个基因(HNF4A、GCK、HNF1α、PDX1、HNF1β、NEUROD1、KLF11、CEL、PAX4、INS、BLK、ABCC8、KCNJ11)与之相关，其中葡萄糖激酶基因(GCK)突变所致的MODY2是最常见的MODY 类型之一，大约占所有MODY 患者的30% ～50%［2］。由于患病率较低(有统计数据表明，MODY 仅占欧美国家糖尿病患者的2% ～5%)［3］，并且其发病年龄及临床表现与1 型和2 型糖尿病有很大相似之处，导致该病的诊断较为困难。但由于该病的明确诊断对患者的治疗指导、预后判断和遗传咨询有重要意义，因此临床上应予以重视。该病在欧美国家报道较多，在我国有数个家系报道［4］，但在河南省内尚无MODY2 家系报道。

1 资料与方法

1.1 研究对象 患者男，14 岁。主诉“发现血糖升高4 个月”。4 个月前至当地医院体检查空腹血糖7.77 mmol/L，餐后2 h 血糖10.48 mmol/L，无口渴、多饮、多尿、消瘦，无手足麻木、视物模糊，诊断为“糖尿病(未定型)”，未服用药物，未严格控制饮食。3月前至南阳市中心医院查空腹血糖7.63 mmol/L，餐后2 h血糖10.22 mmol/L，腹部彩超无异常，骨龄片符合14岁，诊断为“糖尿病(未定型)”，予“格列吡嗪控释片5 mg，早1 片”，后偶测空腹血糖波动于7.30 ～7.88 mmol/L。半月前测空腹血糖7.6 mmol/L，遵医嘱家用“盐酸二甲双胍缓释片0.5 g，晚1 片”，未测血糖。至郑州大学第一附属医院后门诊以“MODY”收入内分泌科。个人史:系第1 胎、第1 产，顺产，无产伤、产后窒息史，身高较同龄人偏低，生长发育及智力发育与同龄人无明显差异。

查体:身高148.5 cm，体质量39 kg，BMI 17.7 kg/m2，余无特殊。入院后查OGTT:空腹为8.9 mmol/L，30 min 为11.0 mmol/L，60 min 为13.4 mmol/L，120 min为13.3 mmol/L，180 min 为9.5 mmol/L;胰岛素释放试验:空腹为5.2 μU/ml，30 min 为11.5 μU/ml，60 min 为28.5 μU/ml，120 min 为55.0 μU/ml，180 min 为18.3 μU/ml;C 肽释放试验:空腹为1.21 ng/ml，30 min 为2.17 ng/ml，60 min 为4.38 ng/ml，120 min 为8.49 ng/ml，180 min 为4.67 ng/ml;胰岛素自身抗体:谷氨酸脱羧酶抗体27 IU/L、胰岛素抗体1.5%、胰岛细胞抗体8.1 IU/ml;脂联素11.62 μg/ml;肝功能、肾功能、血脂、电解质、血常规、粪常规、尿常规、甲状腺功能、24 h 尿蛋白、心电图、腹部及泌尿系彩超、声导抗及纯音听阈检查无异常;传染病四项全阴性;生长激素激发试验:0 min 为12.2 ng/ml，15 min 为23.6 ng/ml，30 min 为45.6 ng/ml，60 min 为41.1 ng/ml，90 min 为23.6 ng/ml;骨龄片符合14 岁。明确诊断后行院外饮食控制，未使用药物治疗，3 个月后于门诊复查，身高150 cm，体质量40 kg，BMI 17.8 kg/m2，空腹血糖7.44 mmol/L，糖化血红蛋白5.7%。

图1 1 个青少年发病的成年型糖尿病MODY2 家系的遗传谱系图

家族史见家系图(图1)，先证者母亲于37 岁时体检发现糖尿病，其祖母、外祖母均发现糖尿病5 a 余，现使用二甲双胍等口服药物治疗，余家族成员筛查空腹血糖及糖化血红蛋白均未发现异常。

1.2 外周血DNA 提取 取患者及家族成员全血各1 ml(肝素抗凝)，用血液基因组柱式小量提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)提取所有家系成员的外周血基因组DNA。

1.3 PCR 扩增并测序 对患者进行PCR 扩增并测序GCK 基因所有外显子，找出突变位于7 号外显子，后对家系成员GCK 基因7 号外显子进行测序。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计及合成:GCK -7F 5’-CGCCTTTCCATTGTTCCAGA -3’，GCK -7R 5’-AGTTTGCTTTTCCCCAGAGTTG -3’。50 μl PCR 总反应体系:DNA 模板1 μl、引物Fi 1 μl、引物Ri 1 μl、10 mmol/L dNTP 1 μl、Taq Buffer 5 μl、25 mmol/L MgCl25 μl、5 U/μl Taq 酶0.5 μl、水35.5 μl。采用美国ABI公司Verity 96well 型PCR 扩增仪扩增。反应条件为预变性95 ℃3 min，变性94℃30 s，退火55℃35 s，延伸72 ℃40 s，共35 个循环，最后72 ℃延伸40 s，72 ℃修复延伸5 min。PCR 扩增产物经英国Syngene 公司凝胶成像仪成像，美国ABI 3730XL 自动测序仪测序。

2 结果

2.1 临床特征 这是1 个早发糖尿病家系(先证者年龄＜25 岁)，连续三代可见家系成员受累，符合常染色体显性遗传。先证者和其他受累者无典型的“三多一少”症状，无酮症倾向，血清GAD 抗体、IAA、ICA 阴性，先证者及受累者均未合并其他器官受累(非糖尿病肾病、胰腺发育不全等)的表现。患者身高较同龄人偏低，但生长激素激发试验正常。在后续随访中发现，患者仅经单纯饮食治疗即可令血糖得到良好控制，血糖水平无进行性加重趋势，身高及体质量增加在正常范围内。

2.2 GCK 基因测序 该家系中连续三代中4 人均发现GCK 基因7 号外显子上的c.1174 G ＞T 突变，均为杂合子突变，测序结果见图2。该突变导致GCK 基因1 条单倍体7 号外显子上的T 碱基变异为G 碱基，造成编码甲硫氨酸变为精氨酸，查阅文献该突变未经报道。先证者符合MODY2 特点，另外3 名携带者中2位已诊断为糖尿病，另1 位突变携带者空腹血糖及糖化血红蛋白均正常，余家系成员均未检测出该突变。

图2 GCK 基因测序结果

3 讨论

临床诊断MODY2 需要要符合以下条件:①年龄＜25 岁;②至少5 a 内无需胰岛素治疗;③无酮症倾向;④空腹血清C 肽≥0.3 nmol/L，葡萄糖刺激后水平≥0.6 nmol/L;⑤有3 代或3 代以上常染色体显性遗传史［5］。在该家系中，连续3 代均可见家系成员受累(糖尿病或空腹血糖受损)，符合常染色体遗传模式，先证者和其他受累者无典型的“三多一少”症状，无酮症倾向，经单纯饮食治疗即可良好控制血糖，且血糖水平无进行性加重趋势。这些临床表现与MODY2 的临床特征高度吻合，强烈提示MODY2 的可能。

葡萄糖激酶(glucokinase，GCK)是一种己糖激酶(hexokinase)，葡萄糖在该酶的催化下转变成6 -磷酸葡萄糖，是葡萄糖代谢的关键酶和限速酶，人GCK 基因位于染色体7p15.3 ～15.1，由12 个外显子构成，编码含465 个氨基酸残基的蛋白［6］。GCK 主要在胰腺、肝脏和部分神经元、肠细胞中表达，已证实GCK 是糖代谢通路的重要组成部分，在维持血糖稳态过程中起关键作用。肝细胞和胰岛β 细胞GCK 基因启动子的差异导致其组织特异性表达和活性调节也有所不同。GCK 在胰岛β 细胞中起着葡萄糖感受器的作用:空腹时GCK 处于失活状态，进餐后血糖升高，激活β 细胞内的GCK 并启动葡萄糖分解代谢，产生大量ATP，触发胰岛素释放入血，而在肝脏表达中表达的GCK 主要作用是促进葡萄糖在肝脏储存为糖原［7-8］。

GCK 基因的双等位突变可引起永久性新生儿糖尿病［9］，而杂合突变则引起GCK 酶活性部分下降，基础血糖水平上升并发生MODY2［10］，在现实中杂合突变更为常见。根据以往对GCK 蛋白结构的研究，现已明确GCK 的葡萄糖结合位点及ATP 结合位点［11］。葡萄糖结合位点的突变会降低酶催化活性，ATP 结合位点附近的突变将会导致ATP -Km 及催化率的改变，甚至失去与ATP 的协同性。GCK 基因c.1174 G ＞T突变造成编码甲硫氨酸变为精氨酸(M391R)，虽然该位点距离GCK 的活性中心(Thr168、Lys169、Asn204、Asp205、Asn231、Glu290)较远［11］，但其为1 个错义突变，不能排除其导致GCK 构型改变而掩盖酶活性部位，影响其酶活性的可能。

GCK/MODY2 突变者空腹高血糖通常是温和的，即使不接受治疗也很少发生微血管或大血管并发症。在儿童期无需进行治疗，且应用口服降糖药及胰岛素的效果常不能达到预期，宜进行饮食控制。由于高血糖容易增加巨大儿和围产期并发症的风险，故合并妊娠的患者可能需要胰岛素治疗，但对于母子均为MODY2 患者的情况，由于胎儿同样对高血糖敏感性降低，故母亲孕期应用胰岛素可能造成胎儿宫内生长迟缓，此时母体血糖水平的控制应以胎儿生长状态确定［2］。将来GCK 激活剂类药物也可用于治疗MODY2。

本文报道了1 例由GCK 基因c.1174 G ＞T 突变导致的MODY2 家系，是河南省首例，该突变国内外均未报道，是1 个新型的GCK 基因突变，该突变可能导致GCK 酶活性下降。尽管MODY 的分子生物学病因未完全阐释清楚，但通过基因诊断测试可以检出目前最流行的亚型，并指导最优化治疗——个体化治疗，该措施能降低糖尿病患者的医疗成本，并将对其长期治疗和遗传咨询带来深远影响。

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