rMBP－NAP依赖IL－12/IL－23轴对肝癌H22荷瘤小鼠的抑瘤作用研究

王小龙 康巧珍 门颖丽 黄夏冰 张亚萌 刘鑫

(郑州大学生命科学学院 河南郑州 450001)

IL－12是一种异源二聚体型促炎性细胞因子，主要由固有免疫细胞如树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等表达[1]。IL－12在连接固有免疫和获得性免疫中起到了重要作用，并在抗肿瘤免疫研究中受到重视。通过IL－12蛋白药物或者IL－12基因药物处理荷瘤小鼠发现，IL－12能显著性抑制肿瘤的生长，其抗肿瘤作用依赖于诱导IFN－γ的高表达[2]。IL－23是同属于IL－12家族中的另一个细胞因子，其与IL－12具有相似的结构，两者具有相同的p40亚基[3]。近年来，随着对IL－23生物学功能研究的深入，IL－23在抗肿瘤中的作用也逐渐受到重视。IL－23能够引起CD8+T在肿瘤组织中的大量浸润，发挥抗肿瘤作用，IL－23的抗肿瘤作用的发挥与细胞因子IFN － γ 表达量增加正相关[4－5]。

幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白(Helicobacter pylori neutrophil－activating protein，HP－NAP)是幽门螺杆菌重要的毒力因子，同时HP－NAP也是一种TLR2激动剂，能够激活中性粒细胞和单核细胞中的TLR2信号通路，并促进其分泌IL－12和IL－23细胞因子。同时，经HP－NAP刺激的中性粒细胞和单核细胞与T细胞共培养后，能够增强T细胞分泌IFN－γ，即促进Th1型免疫反应[6]。有研究证实，HP－NAP具有抑制小鼠H22荷瘤模型肿瘤生长的作用，其中伴随着分泌IFN－γ的T细胞数目的增加[7－8]。结果提示，IFN－γ在HP－NAP发挥免疫调节功能乃至发挥抗肿瘤作用的过程中具有重要作用。而IL－12/IL－23在IFN－γ介导的HP－NAP诱导的抗肿瘤作用中的角色有待于进一步的研究。

本实验室通过分子克隆的方法构建HP－NAP的原核表达载体，成功纯化得到了重组中性粒细胞激活蛋白rMBP－NAP，并在小鼠H22肝癌肿瘤模型中对其抗肿瘤作用进行了评估。进一步利用抗体分别阻断IL－12和IL－23，检测IFN－γ的表达，探究rMBPNAP依赖于IL－12/IL－23的抗肿瘤作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 rMBP－NAP蛋白由本实验室通过Amylose Resin(nEB，England)亲和层析纯化获得;BCA蛋白定量试剂盒购于北京索莱宝生物科技有限公司;RPMI－1640培养基购于北京索莱宝生物科技有限公司;胎牛血清购于浙江天杭生物科技有限公司;IFN－γ ELISA试剂盒购于Biolegend;抗体IgG Control、小鼠anti－IL－12抗体及小鼠anti－IL－23p19抗体购于美国R＆D systems;丝裂霉素 C(MMC)购于Genview。

1.1.2 实验动物 SPF级雌性6～8周 BABL/c小鼠，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号:SCXK(京)2012－0001。饲养于河南省医药科学研究院SPF级动物室，试验过程中动物自由饮食饮水，光照周期为12/12 h。

1.1.3 肿瘤细胞 H22小鼠肝癌细胞系，由河南省医药科学研究院惠赠，培养并保存于本实验室。

1.2 方法

1.2.1 H22荷瘤小鼠模型建立及治疗 将2×106个H22细胞以0.2 ml体积量皮下注射BABL/c小鼠左前肢腋下，荷瘤后第2天将小鼠随机分为两组:PBS组和rMBP－NAP组。PBS组每只注射0.2 ml PBS，rMBPNAP 组每只注射0.2 ml的50 μg rMBP －NAP，连续治疗7 d，期间每天称量小鼠体质量并用游标卡尺测量肿瘤的长(L)和宽(D)，利用公式V=0.5×L×D2计算肿瘤体积。

1.2.2 丝裂霉素C处理H22肿瘤细胞 将H22肿瘤细胞与丝裂霉素C(终浓度为10 μg/ml)于37℃，5%CO2培养箱中共培养。2 h后，移去培养基，PBS洗3次，加入新鲜RPMI－1640培养基，继续培养。

1.2.3 ELISA 检测 IL－12/IL－23抗体阻断后脾细胞中的IFN－γ 荷瘤小鼠模型建立如1.2.1所述，模型期间，荷瘤小鼠不进行给药处理，荷瘤后第8天即处死小鼠，无菌条件下取出脾脏，制成单个脾细胞悬液，调整细胞浓度为1×107个/ml。以2×106个/孔铺于两个24孔板中，同时按10∶1的比例加入相应数量MMC处理的H22肿瘤细胞。向上述脾细胞中每孔同时加入100 μg/ml rMBP－NAP和抗体 anti－IL－12(10 μg/ml)/anti－ IL －23(500 ng/ml)/Goat IgG control，即分为4组，IL－12阻断组，IL－23阻断组，IgG同型对照组以及空白对照组(PBS代替rMBP－NAP且无抗体处理)，分别于抗体加入后3 d和7 d(于第3天每孔加入100 U/ml的重组人IL－2继续培养)，收集培养上清，ELISA法检测培养上清中的IFN－γ。

1.3 统计学处理 采用GraphPad Prism 5.0软件进行分析，定量资料采用均数±标准差(±s)表示，两组间比较采用t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 rMBP－NAP抑制肝癌H22荷瘤小鼠肿瘤生长 荷瘤3 d后，rMBP－NAP组和PBS组小鼠均出现肿瘤，但rMBP－NAP组肿瘤体积小于PBS组。荷瘤后4～7 d，相对于PBS组，rMBP－NAP组小鼠肿瘤体积增长显著减缓(P＜0.05)。第8天牺牲小鼠，称量并比较瘤重，结果显示rMBP－NAP组肿瘤质量显著低于PBS组(P＜0.01)。见图1。

图1 rMBP－NAP抑制H22荷瘤小鼠肿瘤生长

2.2 IL－12和IL－23抗体阻断显著降低IFN－γ的分泌 培养3 d后，对各组脾细胞培养上清中的IFN－γ表达量进行检测，结果显示，与空白对照组相比，rMBP－NAP促进脾细胞分泌大量的IFN－γ。加入anti－IL－12抗体，rMBP－NAP不能有效诱导IFN－γ分泌，低于检测下限。加入 anti－IL－23抗体后，IFN－γ浓度为500 pg/ml，与同型对照抗体组相比，呈极显著性下降。培养7 d后，收集上清并检测IFN－γ表达量，anti－IL－12抗体组(20 pg/ml)和anti－IL－23抗体组(1 000 μg/ml)IFN－γ的表达量仍显著低于同型对照抗体组(1 600 μg/ml)。见图2。

图2 IL－12和IL－23抗体阻断对IFN－γ表达的影响

3 讨论

IL－12是一种促炎性细胞因子，IL－12能够直接作用于T细胞和NK细胞等，增强Th1型免疫反应、细胞毒性T细胞(CTL)反应及NK杀伤作用，对于肿瘤细胞的清除具有重要作用，因此，IL－12被普遍认为是一种强有力的抗肿瘤相关细胞因子。IL－23同属于IL－12家族成员，与IL－12表现出一定的功能相似性，IL－23在抗肿瘤免疫中的作用也逐渐受到人们的关注[9]。HP－NAP被证实能够有效地诱导中性粒细胞和单核细胞表达IL－12和IL－23细胞因子，具有抗肿瘤作用的潜力。实验结果显示，rMBP－NAP能够显著抑制H22荷瘤小鼠肿瘤的生长，瘤体积明显减小，瘤重明显减轻。荷瘤小鼠脾细胞体外以rMBPNAP刺激且分别用IL－12或IL－23抗体阻断。3 d后收集脾细胞培养上清，anti－12抗体处理组检测不到IFN－γ表达，anti－23抗体处理组IFN－γ浓度显著下降(500 pg/ml)。处理7 d后，anti－12抗体组和anti－23与同型对照组相比差异有统计学意义。结果提示，IFN－γ介导的rMBP－NAP的抗肿瘤作用主要依赖于IL－12，且IL－23与IL－12协同作用进一步提升IFN－γ的表达，起到增强抗肿瘤的作用。已有研究证实，在小鼠肿瘤模型中，IL－12和IL－23联合作用能够起到更好的抗肿瘤效果。加入IL－23能够显著增强IL－12的抗肿瘤作用。而IL－23发挥抗肿瘤作用，依赖于机体内源性IL－12[10]。这提示IL－12和IL－23可能通过相互影响、相互促进的方式协同促进IFN－γ表达，从而发挥抗肿瘤作用。本研究对rMBP－NAP在H22荷瘤小鼠模型中的抗肿瘤作用及IL－12/IL－23轴在其中扮演的角色进行了初步的研究，为rMBP－NAP的抗肿瘤治疗应用提供了一定的理论基础。

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